张凤丽答辩ppt课件

原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在 导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。 除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何 其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对 本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文 中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律 结果由本人承担。 学位论文作者签名：张凤丽 日期： 2005年5月18日 1 重组人IFN-2b治疗子宫内膜 异位症模型的免疫机制研究 02级硕士：张凤丽 导 师：谢梅青 副教授 2 前 言 3 研究背景 n子宫内膜异位症(简称内异症)是育龄妇女的常 见病，痛经、不孕为其主要临床表现。 nEM发病率约10%15%。 n不孕妇女中：EM发病率30%50%。 nEM中不孕的发病率为25%35%。 n在慢性盆腔痛患者中经腹腔镜检证实有30% 50%是内异症。 -内异症严重影响了妇女的身心健康内异症严重影响了妇女的身心健康 4 研究背景内异症的病因学说 n经血逆流学说经典学说 n体腔上皮化生学说 n良性转移学说 n环境学说 n基因学说 n免疫学说研究热点 5 研究背景内异症的病因学说 n研究表明76%90%生育年龄妇女会发生经血逆流, 但只有10%15%的妇女患子宫内膜异位症。 n1980年，Weed和Arquemboug就指出子宫内膜异位症 是一种与自身免疫有关的疾病。 6 研究背景内异症的病因学 说 n2001年，Nothnick称内异症为一种自身免疫性 疾病。 n目前学者们认为免疫系统的异常对于子宫内膜 异位症的种植、粘附、生长等各个环节起着重 要作用。 -免疫学说已获得普遍认同免疫学说已获得普遍认同 7 研究背景内异症与细胞免疫 nT淋巴细胞是机体产生特异性细胞免疫应答的 重要细胞： CD3+代表全部T淋巴细胞； CD4+代表辅助性T细胞(Th)； CD8+代表细胞毒性T细胞(Tc)和抑制性T细胞(Ts)； T T淋巴细胞各亚群失衡免疫系统改变淋巴细胞各亚群失衡免疫系统改变 8 研究背景内异症与细胞免疫 n众多研究发现： 内异症患者血清、腹腔液中的CD3、CD4比率 及CD4/CD8比值降低，Th与Ts细胞比例失衡， CD4/CD8比值值倒置，指出子宫内膜异位症的发生 、发展与患者的细胞免疫功能低下有关。 -内异症患者多存内异症患者多存在在细胞免疫功能细胞免疫功能 缺陷或低下缺陷或低下 9 研究背景内异症与体液免疫 n目前国内外学者也证明了内异症患者体内存在下列 抗体增多： 非器官特异性的抗体：抗多核苷酸类、抗组蛋白及抗磷脂、心脂类抗体 、抗Laminin-1抗体等 器官特异性抗体：AOA、AEA等 -内异症患者存在体液免疫反应增强内异症患者存在体液免疫反应增强 10 研究背景内异症与细胞因子 n活化的CD4+辅助细胞分为： Th1细胞：IL-2、IL-12和干扰素-等，反映机体的细胞免 疫状态； Th2细胞：IL-4、IL-5、IL-10和IL-13等, 反映机体的体 液免疫状态 Th1/Th2Th1/Th2细胞因子动态失衡疾病发生细胞因子动态失衡疾病发生 11 研究背景内异症与细胞因子 n目前发现，内异症患者： Th1/Th2细胞分泌的细胞因子水平发生了转变， Th1/Th2失衡，Th1向Th2漂移，使子宫宫内膜能够够逃避免 疫监视监视 及杀伤杀伤 而在异位种植，引起内异症的发发生发发展 。 - -内异症存在内异症存在1/1/2 2失衡失衡 12 研究背景内异症的治疗 药物 性激素 ： 抗性激素类 ： 手术： -此两种方法均没有考虑到内异症此两种方法均没有考虑到内异症 患者整体免疫状态的调节患者整体免疫状态的调节 不良反应多，复发率高，五年复发率均在不良反应多，复发率高，五年复发率均在 4040左右，效果不理想。左右，效果不理想。 单纯切除病灶、术单纯切除病灶、术后复发率高，易造成新粘连后复发率高，易造成新粘连 。 13 研究背景内异症的免疫治疗 n内异症的免疫病因学研究进展： 改善机体的免疫功能新的EM治疗法 -免疫调节剂 n目前一些免疫抑制剂： 如corticoids(类皮质激素)、 indomethacin (消炎痛)、 pentoxifylline (已酮可可碱)等 -其副反应较大，在临床上受到限制 14 研究背景内异症的免疫治疗 抗病毒、抗肿瘤 干扰扰素： 增强巨噬细胞的功能、提高NK细胞活性 减少IgE的产生、调节机体免疫功能 -开始在实验室及临床应用于内异症 15 研究背景内异症的免疫治疗 n1999年，Ingelmo JM等发现IFN-2b腹腔或皮下注射干扰素 治疗内异症模型，发现异位病灶明显缩小；2000年,Baha Fateen等采取腹腔内一次性置入IFN-2b治疗EM患者，复发率 降低，妊娠率提高，推测干扰素可用于内异症的治疗。 n2001年，Shawky Z .A 及 2005年，Nishida M等体外也发现： IFN可抑制异位子宫内膜细胞的DNA合成，促进异位子宫宫内膜 细细胞凋亡。 - -干扰素可作为一种免疫调节剂用于干扰素可作为一种免疫调节剂用于 内异症的治疗内异症的治疗 16 研究背景内异症的免疫治疗 总结：Ingelmo JM实验只是单纯从用药前后病灶大小来推 测干扰素治疗效果，用药的时间过短，而Baha Fateen的 实验也是一次性腹腔用药，Shawky Z .A 及 Nishida M的 实验都是一些体外研究。 -干扰素治疗内异症的具体机理是？干扰素治疗内异症的具体机理是？ 17 研究立题 本研究拟建立SD大鼠子宫内膜异位症模型， 通过不同用药途径观察重组人IFN-2对内异症 异位病灶的作用，并检测内异症大鼠治疗后细胞免 疫和体液免疫的多项指标，探讨重组人IFN- 2 治疗子宫内膜异位症的可行性及临床应用前景。 18 研究目的： 1. 通过成功建立SD大鼠子宫内膜异位症模型，为研究重组人 IFN-2b对此病的治疗效果提供良好的基础。 2.研究重组人IFN-2b不同治疗方案对SD大鼠子宫内膜异位症 模型病灶的发生和发展的抑制作用，探索内异症免疫治疗的 新方法。 3.研究重组人IFN-2b对对大鼠子宫内膜异位症模型细胞免疫及 体液免疫功能的影响，探讨治疗机理。 19 材 料 与 方 法 20 实验步骤及方法 大鼠建模 随机分组 成功后 F F组组 同时药物干预 E E组组 G组D组C组B组A组 测量用药 后病灶大 小 用药四周后，处死大鼠取血清、全血及病灶用药四周后，处死大鼠取血清、全血及病灶 流式测定 T淋巴细 胞亚群 血清IgG、 IgA、IgM 的测定 血清IL-2、 IL-4的 测定 取异位病 灶及盆腔 脏器做病 理 药物、安慰剂干预或不干预药物、安慰剂干预或不干预 21 实验方法动物模型的建立 自体移植（粘膜面裸露）法 移植物成功的指标为： 肉眼观：体积积明显显增大，呈隆起透亮的囊泡状，内部 充满满淡黄色或清亮积积液，或形成灰白色小结结，部分移植 物被结缔组织结缔组织 覆盖，表面血管清晰可见见。 病理示：具有内膜上皮细胞、腺体及间质细胞,部分可 见到分泌活动。 22 实验方法动物模型的建立 分组与用药： 选择异位病灶生长良好的大鼠48只，按异位病灶大小分 层随机法分为五组。 E、F组在建模的同时向腹腔内放入不同 剂量的干扰素 : A组：腹腔持续应用干扰素组(=12):10万单位/次,q2w4w B组：皮下持续应用干扰素组(=12) ：剂量同上 C组：腹腔内注射空白对照组(=8)：NS 0.5ml /次,q2w4w 23 实验方法动物模型的建立 D组：皮下注射空白对照组（n=8）：剂量同上 E组：腹腔单剂量置入干扰素-2b 60万单位组(=12) F组：腹腔单剂量置入干扰素-2b 120万单位组(=12) G组：模型空白对照组（n=8） 于用药四周后处死大鼠，取组织及血液待检 24 实验方法 移植物肉眼观 于用药前后用两脚规测量移植物大小，观察前 后体积（V长宽高）变化，并与对照组相比 较。 25 实验方法 病理检查 在用药前、后分别随机取部分异位病灶组织，处 死大鼠时取肝脏、肾脏脏器连同在位内膜做病理观察， 观察干扰素对异位病灶的影响及对脏器器官的改变。 26 实验方法 全血CD3+、CD4+、CD8+ T淋巴细胞亚群的测定： 流式细胞仪测定法 血清IgG、IgA、IgM含量的测定 ： 免疫比浊法 血清IL-2、IL-4的测定： ELISA法 27 统 计 结果用s表示，数据用SPSS11.0统 计软件处理，组间比较用方差分析及配对t检验 ，各组之间两两比较用LSD方法，若方差不齐用 Tamhane检验。各组生长率相互比较用RC四 格表比较， P0.05为差异有显著性。 28 结 果 29 1、 动物模型制备情况 动物建模后的生长情况 52只SD大鼠 有48只建模成功，成功率为92.3，各个移植部位的异位 内膜生长情况不同： 表1.1.1 未干预时SD大鼠内异症模型异位病灶的生长率 建模位置 建模例数 生长例数 生长率（%） 左卵巢系膜 48 40 83.3 左子宫系膜 48 37 77.1 小肠系膜 48 36 75 右腹壁 48 42 87.5 合计 192 155 80.7 30 1、 动物模型制备情况-移植物 肉眼观 建模成功的病灶（小肠系 膜上） 建模成功的病灶（卵巢旁 ） 31 1、 动物模型制备情况-病理学改变 未干预前异位病灶病理改变： 异位病灶上皮细胞呈高柱状生 长，内膜上皮细胞见核下空泡 异位内腺体数目多，腺腔 大，腺上皮呈柱状或乳头 状，增生现象明显 32 2、重组人IFN-2b对异位内膜干预时模 型的制备情况: 图2.1 未用药时与干扰素干预时各个移植部位的异位内膜生长情况 33 3、重组人IFN-2b对子宫内膜异 位症模型大鼠异位内膜的影响 34 图3.1重组人干扰素-2b用药后肉眼观察移植物体积变化 * P0.05与对照组用药前后比较； P0.05 与 自组用药前比；A、B组用药前比较 35 图3.2 重组人IFN-2b持续用药组对异位内膜病理学 的影响 干扰素皮下持续用药后的异位内膜上 皮及腺体上皮细细胞呈单层单层 分布 40 干扰素腹腔持续用药后异位内膜 上皮细胞坏死脱落 40 36 图3.3 重组人IFN-2b单剂量置入组对异位内 膜病理学的影响 E组用药后异 位内膜上皮 呈单层，部分 细胞已脱落 40 E组用药后部分 上皮细胞仍呈 立方状分布， 核深染，核仁 明显 40 F组上皮 细胞部分 脱离40 E组在位内 膜无明显 变化 40 37 4.重组人IFN-2b对子宫内膜异 位症模型大鼠血浆CD3、CD4 、CD8T淋巴细细胞的影响 38 图4.1 各组大鼠血浆CD3、CD4、CD8T淋巴细胞水平 39 5、重组人IFN-2b对子宫内膜异位症 模型大鼠血清IgG、IgA、IgM的影响 40 图5.1 各组大鼠血清IgG、IgA、IgM水平 *P0.05, 与C、D 、G组比 较 41 6、重组人IFN-2b对子宫内膜异位症 模型大鼠细胞因子IL-2、IL-4的影响 42 图6.1 各组大鼠血清IL-2、IL-4水平 * P0.05与 对照组相比 较； P0.05 与E组相比 较； P0.05 与F组相比 较 43 * P0.05与对照组相比较； P0.05 与E组相 比较； P0.05 与F组相比较 图6.2 各组大鼠血清IL-2/IL-4比值 44 7、重组人IFN-2b对内异症大鼠肝 脏、肾脏的病理影响 干扰素用药后肝脏、肾脏未发生明显病理改变 45 讨 论 46 关于子宫内膜异位症动物模型的 建立及意义 n自发性子宫内膜异位症模型 如恒河猴、南美猕猴、狒狒等发发病率低 ，饲饲养条件高，观观察周期长长，在研究应应用方面受到限 制。 n移植性子宫内膜异位症模型 如裸鼠 、SCID小鼠 不适于研究机体免疫 方面。 47 关于子宫内膜异位症动物模型的 建立及意义 n诱发性子宫内膜异位症模型 猕猴价格昂贵,不易普及； 兔子主要应用于研究内异症对卵子释放、拾卵 、卵子运送的影响； 大鼠性激素水平较较高，动动情周期短且规规律，繁 殖能力快，为经济为经济 型动动物，且模型容易建立，成功率高。 48 n本课题主要是从免疫调节方面探讨重组人干扰素-2b治疗大 鼠内异症模型的机理，因此采用了SD大鼠制备的EM模型。 n建模时间：在动情期或动情前后期 ；建模方法：自体移植法 n依据学说：子宫内膜种植学说；建模部位临床好发部位 -总建模率为92.3 比 Rajkumar K等报道的7585造模成功率高；郑澄宇等报道的 65%造模成功率高 模型的成功建立为研究干扰素对此病的影响及观察其治疗 效果提供了良好的基础 49 重组人IFN-2b持续用药对内异症模 型 大鼠异位内膜的影响 n本研究发现重组人IFN-2b腹腔注射或皮下注射 10万单位持续用药可使内异症模型大鼠异位病灶 体积明显缩小。 n镜下见异位子宫内膜腺体和间质减少，上皮细胞 呈扁平状或坏死脱离，内异症大鼠的正位子宫内 膜也部分出现异位上皮细胞的萎缩，盆腔内粘连 减轻。 50 重组人IFN-2b持续用药对内异症模 型 大鼠异位内膜的影响 n推测IFN连续用药可促进异位子宫内膜的萎缩 ，对子宫内膜异位症的治疗效果良好，皮下用 药与腹腔用药对异位内膜的影响结果相似。提 示在临床上我们可以采取较简便的应用方法 皮下用药法来达到同样的治疗效果。 51 重组人IFN-2b单剂量用药对SD大鼠 内异症模型的成模干预作用 n本研究发现在异位内膜形成前单剂量应用重组人 IFN-2b可明显降低异位内膜的存活率，120万单 位对异位病灶的抑制效果更明显。 n病理显示存活的异位内膜腺体和间质减少，部分有 明显萎缩。但也有部分病灶呈增生现象。 n我们可以推测在异位内膜种植于腹腔内尚未形成异 位病灶之前，预防应用干扰素可以防止子宫内膜异 位症的发生发展。 52 重组人IFN-2b持续用药对内异症 大鼠细胞免疫功能的影响 n本研究发现重组人IFN-2b连续使用四周后，血 清CD3+、CD4百分率及CD4+/CD8+比值均见明显 升高，提示干扰素治疗后，内异症大鼠体内Th增 多，Ts减少，提高了内异症模型大鼠细胞免疫功 能状态，加强了机体对异位内膜的排斥作用，推 测这可能是干扰素持续用药有效治疗内异症、降 低其复发率的机理之一。 53 重组人IFN-2b单剂量用药对内异症 大鼠细胞免疫功能的影响 n本研究发现重组人IFN-2b单剂量应用后CD4T淋 巴细胞百分率及CD4+/CD8+比值明显升高 ，与重组 人IFN-2b持续续用药组药组 相比CD3、CD4T淋巴细细 胞亚亚群百分率降低。 n提示：内异症发生之前应用干扰素可调整机体整体 免疫水平，从而得以减轻延缓内异症的发生发展。 54 重组人IFN-2b单剂量用药对内异症 大鼠细胞免疫功能的影响 n重组人IFN-2b持续用药较单剂量用药对改善 机体的细胞免疫功能效果更好，可能是重组人 IFN-2b用药时间与机体免疫力呈正相关有关 。 n通过本实验可推荐，测定T细胞亚群对于内异症 的疗效观察及预后判断具有一定的临床意义。 55 重组人IFN-2b对内异症大鼠 血清IgG、IgA、IgM的影响 n本实验发现重组人IFN-2b连续用药降低了内异症 大鼠IgG、IgA 水平，推测可能在一定程度上降低 了内异症模型大鼠过高的体液免疫功能。 n预防性应用重组人IFN-2b可能是抑制了大鼠过高 体液免疫的发生，从而阻止了内异症的发生及发展 。 56 重组人IFN-2b持续用药对内异症大鼠 血清IL-2、IL-4的影响 n本研究发现重组人IFN-2b连续用药后内异症模型大 鼠IL-2水平明显升高,IL-2的升高维持了机体的正常免 疫功能 。 nIL-2/IL-4比值的升高提示:重组人IFN-2b可能逆转 了Th1型向Th2型偏移,恢复了Th1/Th2之间的平衡，这 也可能是重组人干扰素-2b持续用药对内异症治疗 作用机理之一。 57 重组人IFN-2b单剂量用药对内异症 大鼠 血清IL-2、IL-4的影响 n研究表明预防性应用单剂量重组人IFN-2b不足以 以刺激Th1型细细胞活化或使活化的T淋巴细细胞产产生细细 胞因子。 n重组人IFN-2b单剂量的置入预防性地减少了Th2细 胞因子的产生，从而预防了Th1型细胞因子向Th2偏 移，此可能是预防内异症发生发展的机理之一。 58 重组人IFN-2b单剂量用药对内异症 大鼠 血清IL-2、IL-4的影响 n临床上，内异症手术后的复发率50左右，根 据本实验结果推测手术后预防性腹腔内放置重 组人IFN-2b可能会预防内异症的复发。 59 重组人IFN-2b对内异症大鼠 肝脏、肾脏的影响 n重组人IFN-2b持续用药或单剂量用药，内异症 大鼠的肝脏及肾脏组织未出现明显病理变化，推 测单剂量或连续应用重组人IFN-2b还不足以导 致机体脏器发生器质性改变，但是否对内异症大 鼠造成远期影响还需进一步探讨。 60 结 论 61 结 论 1. 本研究采用自体子宫内膜移植法建立SD大鼠内异症模 型，成本较低，手术易行，建