抗老年性痴呆药物筛选与评价课件

彭英 中国医学科学院 药物研究所 2012-6-8 抗老年性痴呆药物筛选与评价 2012年“药理学研究新技术新方法” 1 老年性痴呆的介绍 研究老年性痴呆常用的动物模型 研究抗老年性痴呆药物的主要方法 主要内容 2 l又称阿尔茨海默病（Alzheimer s Disease， AD ），是老年人最常见的 一 种病因不明的大脑退行性变性病，是引起痴呆最常见的病因。 l 患者多发病于50岁前后，女性多于男性（约1.52:1）。 l早期最显著的症状为健忘，通常表现为逐渐增加的短期记忆缺失，而长 期记忆则相对不受病情的影响。随着病情的加重，病人的语言能力、空 间辨别能力、认知能力会逐步衰退，并会出现性格和行为的改变。 l在65岁以上的人群中，大约10%患有该病，全世界约有2400万患者。 l目前没有准确诊断和有效治疗的方法。 老年性痴呆 3 Alois Alzheimer AD的历史 Auguste Deter 1906阿尔茨海默首次报告了一例具有进行性痴呆表现的 51岁女性患者。当医生给她看一个物体时，她最初能够 说出这个物体的正确名称，重复几次都是一样，但是以 后突然间，她把一切都忘掉了。当阅读一本书时，她可 能无缘无故地跳过一些句子，她也许会一个字母、一个 字母地拼读每一个字，也许会读起来完全没有抑扬顿 挫。在书写测验时，她会反复书写同一个音节，而完全 忽略其他的音节，因而变得完全错乱，六神无主。当她 讲话时，常常是使用杂乱无章的词句，应用似是而非的 表达方式。 有时，在说话时会突然停下来，一言不发。 不能理解向她提出的任何问题。找不到回自己住处的 路。病情逐渐恶化，四年半后死亡。患者死后病理检查 显示：大脑皮层萎缩，神经原纤维缠结。其后，又有类 似的病例报道。因其发病于老年前期，早期认为这是一 种和老年性痴呆不同的疾病，于1910年把这种病命名为 阿尔茨海默病。 4 AD的分类 AD分为家族遗传性（Familial Alzheimers disease, FAD)和散发性（Sporadic Alzheimers disease, SAD） FAD分为早发型（Early onset，多发病在40-60岁）和晚发型（Late onset AD， LOAD多发病在65岁以上) APP：是第一个在早发家族性AD家系中被发现，定位于21q21.1-21.3，含19个外显子，其中第16 和17外显子编码的APP水解片段A被证实为AD患者脑中SP的主要成分。 PS1/2：PS1基因定位在14q24.3上，含467个氨基酸残基；PS2定位在1q41.2上，含448个氨基酸残 基，PS1基因有100多个突变与常染色体显性遗传早发性AD有关，只有7个这样的突变在 PS2基因被发现。 Tau：Tau蛋白基因位于17q21，包括16个外显子。在中枢神经系统2、3、10外显子间不同mRNA 的剪接，表达6种Tau蛋白的同功异构体。 ApoE：在第19对染色体上，ApoE基因的多态性与AD有着密切关系。在ApoE2,3,4等位基因中， ApoE4等位基因型是AD最主要的危险因素，主要与晚发型的散发性和晚发型家族性AD有 关。 5 年龄是一个主要的危险因素 年龄 患病率 65-743 75-8418.7% 85+ 47 年龄是AD发生的主要危险因素 6 From 2000-2007, Alzheimers Disease Deaths Increased 50.6% while Deaths by: HIV declined 22.0% Stroke declined 18.9% Heart Disease declined 13.3% Prostate Cancer declined 6.4% Breast Cancer declined 3.1% Alzheimers Disease HIV Stroke Heart Disease Prostate Cancer Breast Cancer AD的发病率 7 阶阶段智能测验说测验说 明症状说说明平均期间间退化程度 一（ MMSE ：29-30）正常-成人 二（ MMSE ：29 ） 正常年龄之健忘，与年龄有关之记忆 障碍 （忘记东 西放置的地方及某些字， 减少注 意力） -成人 三轻度神经认 知功能障碍（ MMSE ：25 ） 降低从事复杂工作之能力及社会功能（例 如：完成一件报告） -年轻之成人 四轻度阿兹海默氏失智症（ MMSE ：20 ） 计算能力下降（100-7, 40-4），无法从事 复杂活动（个人理财、料理三餐、上市场 ）， 注意力、计算及记忆 障碍（近期为 主） 2年8 岁-青少年 五中度阿兹海默氏失智症（ MMSE ：14 ） 计算能力明显下降（20-2），失去选择 适 当衣服及日常活动之能力，走路缓慢、退 缩、容易流泪、妄想、躁动不安 1.5年5-7 岁 六中重度阿兹海默氏失智症（ MMSE ：5） 无法念10-9-8-7，需他人协助穿衣、 洗澡及上厕所，大小便失禁，躁动不安， 降低语言能力 2.5年5-7 岁 七重度阿兹海默氏失智症（ MMSE ：0） 需依赖他人持续照顾， 除叫喊外无语言 能力、无法行走，行为问题 减少，增加褥 疮、肺炎及四肢挛缩 之可能性 MMSE从23（轻度 ）0 约6年，每 年约降3-4分， MMSE 到0后可平 均再活2-3年 4 周-15 个 月 AD的临床症状及分型 8 9 The self-portrait of William Utermohlen 10 AD的脑改变 海马参与编码短期记忆，AD首先破坏了海马的神经元以及海马和大脑其他部分的连接通路。这种破坏导致了短期记忆的损伤。 当大脑皮层受累后，语言能力和判断能力就被削弱，人格也发生了改变，包括情绪的爆发以及烦躁的行为。 最后全脑受累萎缩。 11 AD的脑改变 AD大脑体积和重量都会缩小，大脑皮质变得空虚而满是裂隙。 12 Neurofibrillary Tangle Senile Plaque AD特征性的病理改变 13 (Selkoe DJ, Physiological Reviews 2001) Amyloid Precursor Protein Processing and A generation 14 A40 Fragment Soluble A42 Fragment Unsoluble, aggregates into plaques Neurofibrillary Tangles Formation p35 p25 CDK5 Akt GSK-3/ Calpain 15 Neurofibrillary Tangles Formation 16 A蛋白毒性学说 Tau蛋白异常与神经纤维缠结 基因突变学说 胆碱能系统异常 氧化应激 炎症反应 神经递质失调 神经元凋亡 微量元素代谢紊乱 胆固醇代谢异常 AD的发病机制 17 Current Therapies 1.与神经递质有关的药物 胆碱能药物：胆碱酯酶抑制剂、M胆碱受体激动剂 非胆碱能药物：单胺氧化酶抑制剂 2. NMDA受体拮抗剂：美金刚 3.抗氧化剂：VitE、CoQ10、EGb761 4.非甾体类抗炎药 5.神经营养因子：NGF、BDNF 6.雌激素 7.脑细胞代谢增强剂 脑细胞代谢激活剂：脑复康、奥拉西坦 脑血循环促进剂：都可喜、喜得镇 钙离子拮抗剂：尼莫地平、氟桂嗪 8. 针对A的治疗 BACE抑制剂、分泌酶抑制剂、防止A形成寡聚体、增强A从大脑中清除、金属离子 螯合剂、调整体内胆固醇平衡、 A抗体等。 9.以tau为靶点的治疗 微管稳定剂、GSK-3抑制剂、CDK-5抑制剂、tau抗体。 18 Current Therapies 药药品名类类型及适应应症作用机理常见见副作用推荐剂剂量 美金刚刚 Namenda (memantine) NMDA拮抗剂 ，用于中到重度 痴呆，可与 AchE抑制剂合 用 保护神经细 胞免遭 过量兴奋 性氨基酸 的毒性作用 头晕 、头痛、便 秘、意识模糊 初始剂量：5mg/d, 前3 周应按每周递增5mg 剂量的方法逐渐达到 维持剂量10mg,bid 加兰兰他敏 Razadyne (galantamin e) AchE抑制剂,用 于轻到中度AD 可逆性AchE抑制剂 ，又是烟碱受体调 节剂 ，具有双重作 用 恶心、心动过 速、失眠、体重 下降，食欲差 初始剂量：4mg,bid,每 四周增量8mg,达维持 剂量12mg,bid 艾斯能 Exelon (rivastigmin e) AchE抑制剂,用 于轻到中度AD 乙酰胆碱酯酶、丁 酰胆碱酯酶抑制剂 ，具有双重作用 胃肠道症状及昏 睡、疲劳 初始剂量为1.5mg bid, 每2周提高剂量3mg,渐 达到维持量6mg bid 安理申 Aricept (donepezil) AchE抑制剂,用 于轻、中、重 度AD AchE抑制剂恶心、呕吐、腹 泻 初始剂量为5mg qd, 4 周后加量至10mg qd维 持 19 A-Based Therapeutics (Barten DM CP27-total human tau AT180, CP9, and CP17-pThr231-tau; AT8-pSer202/pThr205-tau AT100-pThr212-tau in the NFT-specific conformation MC1-tau in the early NFT conformation PHF-1-tau in the late NFT conformation polyclonal P-tau (ser199) antibody; polyclonal P-tau (Thr205) antibody polyclonal P-tau (ser396) antibody; polyclonal P-tau (ser404) antibody 66 tau磷酸化及NFT检测 3. Tau和NFT 的染色 方法：IHC， IF Fluorescent double labeling of 3xTg-AD mice. Intraneuronal A (green) colocalizes with Tau (red) within CA1 pyramidal neurons of 12-month-old (A) and 18-month-old (B) 3xTg-AD mice and within 18-month-old neocortex (C). Tau immunoreactivity (red) also colocalizes with an early tangle marker, MC1 (green), within CA1 pyramidal neurons at both 12-month (D) and 18-month time points (E and F). Phospho-tau immunoreactivity from the CA1 hippocampal sector of 18-month-old transgenic mice. Immunohistochemistry performed with T-14 (AC), 12E8 (DF), AT-180 (G), AT-8 (H) and PHF-1 (I). 67 tau磷酸化及NFT检测 4. Tau蛋白磷酸化激酶的检测 方法：Western blot和酶活性测定 Immunofluorescence staining of GSK-3(Ser9) (green) 68 氧化损伤的检测 检测指标： 活性氧自由基（ROS）、超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、总- SOD） 、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽-过氧化物酶（GSH-PX）、黄嘌呤氧化酶 （XOD）、髓过氧化物酶（MPO）、过氧化物酶(POD) 、一氧化氮合成酶（NOS ） 、丙二醛（MDA）、 4-羟基壬烯醛（HNE）、还原型谷胱甘肽（GSH）、超 氧阴离子自由基、一氧化氮（NO） 方法：生化测定 公司：南京建成生物工程研究所 69 神经炎症反应的检测 70 神经炎症反应的检测 1.小胶质细胞活化 方法：IHC、IF、Western blot 常用抗体：CD45、CD11b、CD40、Iba-1、F4/80、CD68、MHC-II、 ED1、 Mac-1等。 Microglia (Iba-1, brown) accumulate around A plaques (Congo red, red) in transgenic mouse models of AD. Double-labeling immunofluorescence analyses of A deposit and microglia marked by IL-1 (A) and CD11b (B) in representative 10-month-old Tg2576 mouse. 71 神经炎症反应的检测 2. 星型胶质细胞活化 方法：IHC、IF、Western blot 常用抗体：GFAP Double-labeling immunofluorescence analyses of A deposit (red) and astrocytes (green) marked by glial fibrillary acidic protein (GFAP) in a representative 10-month-old Tg2576 mouse. 72 神经炎症反应的检测 73 神经炎症反应的检测 3. 细胞因子的检测 方法：ELISA、Western blot、 Multiplex Cytokine Assay 常用抗体：IL-1、TNF、IL-6， TGF、IFN-等。 Novex ELISA kits can be used for single-protein measurement to further evaluate individual cytokine targets by using the Luminex 200 system. 74 神经退行性改变的检测 检测指标：NeuN、synaptophysin、MAP2、 CC1 常用方法：IF 75 J20;C3-/-J20 NeuN stains most differentiated neurons, but degenerating neurons seem to lose this marker. Non-tg J20;C3-/-J20 CA1 CA3 Synaptophysin is a synaptic molecule present in presynaptic terminals and a robust marker for functional neurons. microtubule-associated protein 2 (MAP2) in APP transgenic mice. MAP2, a marker of dendritic integrity. immunofluorescence labeling in CC1 -labeled oligodendrocytes 神经元凋亡的检测 76 神经元凋亡的检测 77 检测指标：Caspase-3， cytochrome C、Bcl-2 family、Annexin V/PI、 常用方法：PCR、Western blot、Flow cytometry、Caspase酶活性、TUNEL染色、IHC、IF Tg2576 hippocampal dendritic spines accumulate active caspase-3 in the postsynaptic compartment and show apoptotic features. 神经发生的检测 78 检测指标：BrdU、DCX ，Neuro D、TUC4 常用方法：Western blot、IHC、IF Neurogenesis in AD patients and normal control. BrdU反应细胞的增殖； Dcx 是在迁移和分化中的新生神经元上的一种微管相关蛋白其主要表达在迁移中的神经元胞体和前导突起上以及分化中的神经元轴突上。 Neuro D是神经源性的分化因子 神经发生的检