毕业论文--EM发酵秸秆饲料的应用研究.doc

em发酵秸秆饲料的应用研究摘要：进行了玉米秸秆、稻草、花生秧、麸皮的各种常规成分的测定和em发酵实验。结果表明em 能发酵各种秸秆及含高纤维的其它植物原料能够显著提高粗蛋白含量，改善饮料性能，对影响em 发酵玉米秸的温度、时间、水分三因素作了交叉分组实验，通过ndf，adf含量分析，探索了各因 素有交互作用对秸秆发酵效果的影响，对秸秆饲料的开发应用有较大的应用价值。 关键词：em；秸秆；粗蛋白；生物转化em液发酵秸秆饲料是一种新型的微生物技术，em是一种把厌氧菌和好氧菌共存的活菌制剂。依靠改善动植物体内各环境微生物而发挥作用。组成em有效微生物菌液的有效微生物群是由光合菌，乳酸菌，纤维素分解菌，半纤维素分解菌，酵母菌，放线菌，固氮菌等5个科，10个属的80多种有效微生物组合而成，通过这些对分解秸秆有效，对动物生长和防病有益的微生物群的作用，在一定温度和厌氧条件下实现秸杆的生物转化和饲料转化。 目前，在全国不少地区，大量农作物秸杆没有得到充分利用，有的堆积在田埂和路旁，多数在田间付之一炬。这种处理方法不但浪费资源而且会造成严重的环境污染，破坏生态平衡。如果能把秸杆通过科学的加工与调制，即可用来饲养牛羊等草食家畜，发展秸杆畜牧业，这是一个一举多得的“绿色事业”，本试验取南阳市周围农村的玉米秆，花生秧，稻草。研究em发酵各种秸秆的作用效果和最佳作用条件，使em发酵秸秆饲料能够推广应用。 1.材料和方法 1.1材料：em原液，南阳市周边农村的玉米秆、稻草、花生秧。 1.2方法：本试验测试项目为：1水分 2粗脂肪 3粗纤维 4粗蛋白 5灰分 6中性洗涤纤维 7酸性洗涤纤维 1.2.1水分的测定 1.2.1.1 仪器：粉碎机，烘箱，天平，称量瓶，干燥器 1.2.1.2 步骤：称2g试样置100-105干燥恒重后称量瓶中，在100-105度烘箱中干燥3-4个小时，取出置干燥器中，冷却至室温，称重。再于相同温度下干燥1小时左右，同上操作至恒重。 1.2.1.3 计算 水分（%）=100%（w1w2）/（w1w0） w0瓶重（g）， w1干燥前试样与称量瓶重（g） ，w2干燥后试样与称量重（g） 1.2.2粗脂肪的测定： 1.2.2.1 原理：乙醚提取试样，称重提取物的重量，除脂肪外还有有机酸、磷脂、脂溶性维生素、叶绿素等。固而称粗脂肪。 1.2.2.2 仪器：a、粗碎机 b、分样筛0.45mm c、水溶锅 e、恒温烘箱50500 f、索氏脂肪取器(带球形冷凝管)100或150ml . g、滤纸(中速脱脂). 1.2.2.3 试剂：无水乙醚(分析纯) 1.2.2.4 测定步骤： a、 索氏抽取器应于燥无水。抽提瓶(内有沸石数粒)在105烘箱中烘60 min至干。干燥器中冷却30 min，称重。再烘干30min,同样冷却、称重，再次重量之差小于0.0008g为恒重。 b 称取试样125g(准确为0.0002g) 于滤纸筒中,或用滤纸包好.放入105烘箱中烘干60min。干燥器中冷却30min，称重再烘干30min，同样冷却称重,再次重量之差小于0.0008g为恒重. c、 称取试样15g(准确度0.0002g),于滤纸筒中,或用滤纸包好,放入105烘箱中,烘干2h(或取测水分后的开试样,折算成风干样重).滤纸筒应高于提取器虹吸管的高度。滤纸包长度应全部浸泡于乙醚中为准，将滤纸筒或包放入抽提管)在抽提瓶中加无水乙醚60100ml.在6075水浴上加热，使乙醚回流，控制乙醚回流次数为每小时约10次，共同回流约50次或检查抽提管流水的乙醚挥发后不留下油迹为抽提终点。 d 、取出试样,仍用原撮器回收乙醚直到抽提瓶几乎全部收完，取下抽提瓶，在水浴上蒸去残余乙醚.擦净瓶外壁，将抽提瓶放入105烘箱中烘干2h,干燥器中冷却30min称重，再烘干30min，同样冷却称重。两次的重量差小于0.001g为恒重。 1.2.2.5计算： 粗脂肪(%)=100%（m2m1）/m m用干试样重量 m1已恒重的抽提瓶重量(g) m2已恒重的盛有脂肪的抽提瓶重量(g ) 1.3 粗纤维的测定: 1.3.1 原理： 试样经酸、碱处理后，使淀粉、半纤维素、蛋白质、脂肪等变成可溶性物质而被除去，残剩的纤维素和其他植物质的膜壁等。统称为粗纤维素，称重定量。对含油脂较高的试样可用硝酸醋酸处理试样。 1.3.2 试剂：a、1.25% h2so4 溶液。b、.25% naoh 溶液c、乙醚d、乙醇 1.3.3 测定步骤 准确称取g试样，置入500ml三角瓶中，加入100ml 乙醚，盖严，静置过夜，以除去脂肪。用倾泻法除去乙醚层，再用乙醚洗涤残渣，残存少量乙醚于水浴中蒸发除去（或直接取测定粗脂肪后的残渣进行测定）。200 ml1.25%硫酸溶液煮沸半小时，抽滤（滤器可用布氏漏斗，上铺亚麻布或府绸或用1-2号耐酸玻璃过滤器），用热水洗涤到滤液呈中性。 将残渣用1。25%naoh溶液转入500ml烧杯中，补足1.25% naoh 溶液至200ml 盖上表面皿煮沸半小时（小火）。用古氏坩埚抽滤（30 ml, 预先加入酸洗石柿悬乳液30ml（内含酸洗石柿0.2-0.3g） 再抽干，石棉厚度均匀，不透光为宜，上下铺两层玻璃纤维有助于过滤。）用热水洗涤至滤液呈中性，再用乙醇，乙醚洗涤。将古氏坩连同纤维素，于100-105干燥至恒重w1，然后燃烧至恒重（w2） 1.3.4 计算。粗纤维素（%）=100%（w1w2）/w w试样重量（g） 1.4 粗蛋白的测定 1.4.1 原理：将试样与浓h2so4共热消化,使pr分解其中n与h2so4化合成(nh4) 2so4,然后碱化蒸馏使氨游离，用标准酸接收，过量酸用标准碱滴定。 总氮量除pr外，还有氨基酸、酰胺、核酸中的氮，换算成蛋白质，称粗蛋白。 1.4.2 试剂：a、浓h2so4 b、k2so4 c、 cuso4.5h2o d、 h2o2 (30%) e、naoh（30%） f、 0.1(nh4)2so4 g 、 0.1 n naoh h、 0.1%甲基红指示剂 1.4.3 步骤： a 、 试样消化，取2g试样置入250ml凯氏定氮瓶中，加3gk2so4 和1g cuso4,加20ml浓h2so4 ，瓶口安放小三角漏斗，于电炉上加热消化。若消化色泽难退，则冷却后，加3-5mlh2o2，继续加热，直至清彻透明为止。冷却，转入100ml容量瓶中(先加20ml水)，充分洗涤凯氏定氨瓶，冷却至室温，再用水定容至刻度摇匀。 b 加碱蒸馏:吸取50ml稀释消化液，置入500ml平底烧瓶中，加约100ml水和数粒沸石，加入60ml30%naoh液.或在烧瓶上安一分液漏斗加碱，立即盖严，蒸馏约45分钟（或蒸出原液体积的1/3），接收瓶中先加入25或50ml 0.1na2so4。. c、滴定，蒸后，用水洗涤冷凝器，取出接收瓶，加4滴0.1%甲基红指示剂，用0.1naoh滴定至黄色。 d计算,含氮(%)=(nv)h2so4 -(hv)naohx0.01401x(100/50)x(1/w)x100% 0.01401氮的mg当量， 100/50稀释倍数， w样重 粗蛋白(%)=6.25x含氮(%) 1.5灰分的测定 1.5.1.原理：试料在550燃烧所得残渣，用质量百分率来表示，残渣中主要是氧化物、盐类等矿物质，也包括混入饲料中的砂石、土等，故称粗灰分。 1.5.2.仪器：a ,粉碎机 b, 分样筛 孔径为0.45mm(40目) c，分析天平 0.0001g d. 高温炉 550 -20 e 坩埚瓷质容积50ml f， 变色硅胶作干燥剂 1.5.3测定： 将干净坩埚放入高温炉，在550下灼烧30min，取出在空气中冷却约1min，放入干燥器冷却30min，称量，再重复灼烧，冷却，称重，直至两次质量差小于 0.0005g为恒重。在已恒重的坩埚中称取2-5g (灰分质量0.05g以上).试样，准确至0。0002g，在电炉上小心碳化，在炭化过程中，应将试料在较低温度状态加热灼烧至无烟，然后升温灼烧至样品中基本无炭粒。再放入高温炉，于550下燃烧3h，取出，在空气中冷却约1min，放入干燥器是冷却至30min，称重，再同样燃烧1h，冷却，称重，直至两次质量之差小于0.001g为恒重。 1.4 结果计算和表述 粗灰分（%）=(m2-m0)/(m1-m0) *100% m0恒重空坩埚重 m1加试样品的坩埚重 m2灰化后坩埚重2. 实验方案设计 2.11 麸皮、玉米秆、稻草、花生秆的常规成份测定与分析 2.12 发酵麸皮单因素试验，取四个因素：（1）接种量（2）温度3时间（4）水分，以粗蛋白为主要指标 2.13 发酵玉米秆的温度、时间、水分三因素交叉试验 2.14 发酵稻草、花生秆初探 2.2 测定定项目 水分%、粗蛋白%、粗脂肪%、粗纤维%、粗灰分% 无机氮浸出物%=100%水%粗蛋白%粗纤维%粗灰分%1、发酵麸皮 接种量温度时间水分 1 2d30% 1.5%3d40% 204d50% 2.555d60% 2.3 发酵玉米秆 温度a、时间b、水分c，以1%的接种量三因素交叉分组设计 发酵时间b1（15天）b2（30天）料水比c1(1:1)c2 (1:2)c1 (1:1)c2 (1:2) a1 15a111a112a121a122 a2 20a2111a212a221a222 a3 25a311a312a321a322 a4 30a411a412a421a422 试样分析项目 ： vansoest法测定试样中性洗涤纤维（ndf）酸性洗涤纤维（adf）的含量 3. 试验结果与分析 3.1 发酵麸皮单因素试验 3.1.1 温度（2%接种量、50%水分、4天） 温度25303540 粗蛋白275337210206 分析:25条件下培养时,菌体生长速度比较迟缓,35 ,40 条件下培养,初生长速度较快,达到峰值后快速进入衰亡期,粗蛋白含量不高,30培养对em的生物转化较为适宜. 3.1.2 含水量 (30 2 4天) 含水量30pp% 前后粗蛋白变化量2%3% 分析:含水量在50%-60%时比较有利于菌体的繁殖生长，含水量在40%以下时em菌体蛋白增长缓慢，粗蛋白含量无明显增加，而基料含水量高于60%时，则由于出现过多的游离水，使得酶和营养物质的传逆性较差，阴碍了em菌体繁殖，所以菌体蛋白增长也呈缓慢趋势，此时微生物呈现表面生长现象。 一般来说，真菌可以在没有游离水的基质上生长良好，而酵母，细菌必须在含水量为40%以上的基质上才能生长，若要长生良好则需有充分的游离水，适量的游离水有利于营养物质的渗透传递，也利于酶及代谢产物的扩散。 3.1.3 接种量（30 50%水分 4天） 接种量1%1.5%2%2.5% 粗蛋白22.9.84.54.6% 分析:em在基料上生长繁殖,提高了基料中粗蛋白的含量,em接种量不同其生物转化效果不同,从上面实验看出%的效果最好 3.1.4 发酵时间不同时的情况发酵时间0d2d3d4d5d 粗蛋白17.8&.6).73.7.5% 分析：第四天菌体数达最大值，粗蛋白含量最大。 小结：现初步确定最佳条件，即基料中，初始含水量为50%，接种量为2%、培养温度为30 发酵4天,发酵状况最佳. 3.2 玉米秆、花生秆、稻草、小麦 常规成份测定结果及分析 水分%干物质%粗蛋白%粗脂肪%粗纤维% 粗灰分%无机氮浸出物% 皮11.1988.8115.233.98.94.756.08 玉米秆10.6689.349.193.0927.713.3136.05 稻草12.8387.175.181.435.614.7830.21 花生秆12.2487.7611.833.232.422.5927.74 分析：农作物秸秆是由大量的有机物和少量的无机盐及水所构成。其有机物的主要成份是纤维素类的碳水化合物，此处还有少量的粗蛋白和粗脂肪。碳水化合物由纤维类物质和可溶性糖类组成。纤维素类物质是植物细胞壁的主要成份，它包括纤维素，半纤维素和本质素等，用粗纤维表示；可溶性糖类用无氮浸出物表示；秸秆中的无机盐用粗灰分表示，由硅酸盐和其它少量微量元素组成，含量大约为6%，但有的高达12%以上。农作物成熟后其秸秆中的维生素差不多全被破坏了，含有很少。 农作物秸秆由许多植物细胞组成，所有的秸秆细胞可以分为细胞内容物和细胞壁两部分。秸秆用中性洗涤剂（ph7）消化（煮沸1小时）。细胞内容物溶于中性洗涤剂中，不溶的就是细胞壁，细胞壁是纤维素多聚物。经中性洗涤剂消化而得的纤维叫中性洗涤纤维（ndf）随后将中性洗涤纤维用酸性洗涤消化，能溶于酸的叫酸性洗涤可溶物，不溶的物质叫酸性洗涤纤维。能溶于酸的物质大部分是半纤维素和细胞壁含氮物质。不溶于酸的酸性洗涤纤维，又分为纯纤维素和酸性质素，木质素经灼烧成灰分，灰分是由各种无机盐组成的。成份（%干物质fdm粗蛋白cp中性洗涤纤维 ndf酸性洗涤纤维 adf 稻草90.34.469.156.9 玉米秸93.29.269.7743.74 花生秧88.011.236.627.8 秸秆营养价值的限制性 由于农作物秸秆化学成分的特性，其营养价值很低，用它作为主要粗饲料来饲养反刍动物，尚具有许多限制性因素。一是纤维素类物质含量高，水稻、小麦和玉米三大作物秸秆的中性洗涤纤维分别为61.9%-74.4%，67.1%-73.0%和60.4%-71.9%；酸性洗涤纤维分别为40.2%-53.0%，53.0%-56.2%和37.4%-51.1%。可见中性洗涤纤维一般高于60%，酸性洗涤纤维高于40%。 二是粗蛋白含量低，稻草，麦秸和玉米秸的粗蛋白含量分别为3.8%-5.9%，4.0%-5.1%和8.8%-9.6%，一般平均为3%-6%可见，秸秆饲料不仅可发酵氮极低，而且过病胃蛋白也几乎为零。三是无机盐含量低，并缺乏动物生长所必需的维生素a，维生素d，维生素e等，以及钴、铜、硫、硒和碘等矿物质元素。例如，秸秆饲料中含有大量的硅酸盐，它严重影响病胃中多糖类物质的降解作用，ca和p的含量一般也低于牛、羊的营养需要水平，许多地区钴、锌、硫、硒和铜等元素也明显缺乏。四是可消化能值很低。由于上述秸料的营养限制因素，严重影响了家畜对秸秆饲料的采食量和营养物质的消化率，从而制约了动物生产性能的表现。因此要科学地利用秸秆来饲喂家畜，必须利用em来提高秸秆饲料营养价值这一有效途径，这个途径是秸秆的综合处理和营养物质的添补。 3.3 玉米秸交叉分组发酵试验 按玉米秸粉量的1%接em菌种，并接料水比1：1，1：2加水，充分混匀，ph值取自然，分装500ml瓶中密封。分别在15、20、25、30的温度下发酵15天，20天。 取发酵后的试样，置60 烘箱烘干，制成风干样，经受40目筛的粉碎机粉碎，然后严格按4分法取样以各分析，通过色泽、质地、气味等观察发酵试样的品质。 测定中性洗涤纤维ndf，酸性洗涤纤维adf的含量。 3.3.1 原玉米秸中部分营养成分含量 营养成分dmndfadf 含量?2169.7743.74 试验所得数据：统计用excel进行，方差分析及多重比较用sas软中的anova过程进行。 3.3.2 不同条件下发酵样品的ndfdf含量（%）发酵时间料水比15202530 mdf15d1：11：1 6451 0.376337 0.876391 0.6263.06 0.80 1：26770 0.756753 0.876754 0.656943 0.86 20d1：16029 0.696233 0.886241 0.726567 0.69 1：26537 0.756194 0.856499 0.873856 0.68 adf15d1：13914 0.64052 0.634052 0.834334 0.65 1：24263 0.674198 0.984093 0.924175 0.89 20d1：13786 0.913984 0.853898 0.923921 0.76 1：24193 0.783982 0.844099 0.294056 0.83 分析结果：发酵试样均色泽鲜黄，质地变软，透有酸香气味，无霉败异味。不同条件下经em发酵的饲料试样品的ndf和adf含量显著低于其它处理组合。 3.3.3 同因素对发酵玉米秸纤维含量的显著性比较（最小显著差数法）因素交互作用abcaxbaxcbxcaxbxcndf*ns*adfns*ns*ns*(* 表示差异显著 p0.05, ns表示差异不显著 ) 由上表可见温度a,时间b，水分含量对em发酵玉米秸中的ndf含量影响均显著p0，05；且温度和水分（axc），时间和水分（bxc）及温度和时间和水分（axbxc）对其影响也显著，但对于adf含量只有发酵时间a，温度b，水分含量c及（axbxc）的影响显著，其它均不显著。 3.3.4 不同因素各处理组合adf平均数：邓肯多重比较lsr 处理组合a4b1c2a1b1c2a2b1c2a1b2c2a4b2c1a3b2c2a3b1c243.3442.6341.9893.4175.4099.4040.9aababcabcbccdcda3b1c1a2b1c1a2b2c1a2b2c2a1b1c1a2b2c1a4b1c1a1b2c140.5240.5239.8438.8239.1438.9838.5637.86cdecdedefdefefgfgfgg em发酵玉米秸秆饲料试样感官品质说明，em生物体系在厌氧酸化的微生态可抑制其它微生物区系的生长繁殖，使发酵秸秆在不灭菌的情况下不霉败变味无素安全。由于微生