医学课件黄酮及金属离子对葡萄糖苷酶的抑制作用研究

* 更多医学精品 尽在医学吧 /rayshiu * 化学生物学综合实验六 指导导教师师：马马林 化学与化学工程学院 黄酮及金属离子 对-葡萄糖苷酶 的抑制作用研究 * 一、实验基本原理 -葡萄糖苷酶(-glucosidase)是一 类能够从含有-葡萄糖苷键底物的非 还原端催化水解-葡萄糖基的酶的总 称，包括麦芽糖酶、异麦芽糖酶、蔗 糖酶等，又叫-D-葡萄糖苷水解酶。 位于小肠绒毛粘膜细胞刷状缘的-葡 萄糖苷酶在机体的代谢过程中起着十 分关键的作用，参与了人体对摄入的 淀粉和蔗糖等碳水化合物的消化吸收 、糖蛋白和糖脂的加工，与许多因代 谢紊乱失调而引起的疾病、神经细胞 的分化、肿瘤的转移以及病毒和细菌 的感染有密切关系。 另外在生物体内，大多数蛋白 质都是以糖蛋白形式存在，它 们包括酶、免疫球蛋白、载体 蛋白、激素、毒素、凝集素和 结构蛋白，涉及到细胞识别、 信息传递、激素调节、受精、 发生、发育、分化、神经系统 和免疫系统恒态维持等各个方 面的功能。许多疾病的发生和 发展，如炎症及自身免疫疾病 、老化、癌细胞异常增殖及转 移、病原体感染等都与糖蛋白 寡糖链的变化密切相关。 * -葡萄糖苷酶抑制剂 v 因此，通过抑制-葡萄 糖苷酶的活性可以达到治 疗某些疾病的目的，研究 最为成熟的是治疗型糖 尿病的口服降糖药物。 v 其作用机制为：竞争性抑 制位于小肠的各种-葡 萄糖苷酶，使淀粉类分解 为葡萄糖的速度减慢，从 而减缓肠道内葡萄糖的吸 收，降低餐后高血糖。 v 同样也可以针对糖链的变 化，利用小分子化合物抑 制糖苷转移酶和糖苷酶的 催化活性，可以控制糖链 的合成和水解，从而达到 治疗疾病的目的。 v 因此，能够阻断寡糖链生 物合成的-葡萄糖苷酶 抑制剂，也被用作抗病毒 和抗肿瘤的药物。 * 目前临床使用的-葡萄糖苷酶抑制剂 具有降血糖作用的-葡萄糖苷酶抑制剂 具有抗病毒作用的-葡萄糖苷酶抑制剂 * 二、实验过程 酶抑制剂的高通量筛选可以 通过酶标仪进行，但系统地 、准确地研究抑制剂的IC50 以及抑制作用的动力学必须 通过精密仪器进行检测。 本实验将利用紫外-可见分 光光度计测试几种化合物对 酵母-葡萄糖苷酶 的抑制 作用以及协同抑制作用。 实验材料： 酵母-葡萄糖苷酶（ Sigma公司）。 抑制剂：槲皮素、染料 木素、葡萄糖、果糖、 硫酸铜、氯化锌。 底物：对硝基苯酚葡萄 糖苷（pNPG，Sigma公 司） * 实验仪器和条件 北京普析通用UV-1901 紫外 可见分光光度计 实验条件： 缓冲液：0.01mol/LpH 6.8 或7.0磷酸盐缓冲液。 底物：3mg/mL对硝基苯酚葡 萄糖苷； 化合物溶液的配制： 槲皮素、染料木素用DMSO配 成50mol/L。 葡萄糖、果糖用水配成 100mol/L。 氯化锌和硫酸铜用蒸馏水配 成50mol/L。 * 实验安排 1，酶催化条件探索 由于每次实验得到的酶 催化活性不同，所以每次在 测试过程中，需要探索实验 中所使用的酶的剂量。 本实验要求测试的酶催 化活性-每分钟OD值变化在 0.1-0.13范围内。本实验采 用调节酶液用量或增加底物 用量的方式。 2，测试体系 在总计1000L的测试体系中 ，加入920或930L 0.01mol/LpH 6.8磷酸盐缓 冲液，10L样品溶液（以10 L缓冲液或DMSO做对照）， 10-20L酶液，室温放置20 分钟，立即加入20-50L 3mg/mL对硝基苯酚葡萄糖苷 溶液， 400nm进行时间扫描 ，记录1分钟的OD值. * 实验安排 3，抑制剂IC50的测试 改变样品溶液的剂量，分 别测试酶催化活性。可以通过 稀释的方式改变样品的浓度。 以没有加入样品的酶催化 活性OD/min值为100%，用抑制 百分数(指被抑制而失去活力 的百分数)表示不同浓度样品 对酶的抑制活性，作图求出抑 制50%时样品的浓度。 * 实验安排 4，抑制剂动力学的测试 适当选择2个不同的样品浓 度，以及没加样品三个系列， 改变底物溶液的剂量，分别测 试酶催化活性。 以底物浓度（mol/L）倒 数1/S对酶催化活性OD/min 值的倒数1/V作图，根据三条 线的交点判断抑制剂的类型。 * 协同抑制作用研究 v 酶是生物体内重要的生物大分子，有着特殊的催化功能， 与许多疾病的产生和发展都有着密切联系，是药物开发设 计的一个常见的靶点。而且，酶除了其活性中心可以与专 一的底物互相结合外，其他的部位也可以与不同的物质结 合，使酶的活性发生改变。 v 因此，我们可以设想用不用抑制类型的抑制剂同时对酶进 行抑制，产生协同抑制的效果，令酶的活性比使用单一抑 制剂时更低的同时，也可以减少抑制剂的用量，产生 1+12的效果。 v 由于-葡萄糖苷酶有多个性质不同的抑制位点，因此我 们可以推测，利用不同类型的抑制剂(竞争性抑制剂、非 竞争性抑制剂以及金属离子)可以起到协同抑制的效果。 * 实验安排 5，协同抑制作用的测试 通过稀释的方式分别改变槲皮 素、果糖、锌离子样品溶液的 浓度、剂量，测试两种或三种 样品对酶的抑制催化活性。 将两种或三种化合物单独测出 的抑制活性相加，得出加合后 的抑制活性，与两种化合物或 三种化合物混合测出的抑制剂 活性比较，可以看出是否存在 1+12的协同抑制作用。 * 三、实验报告 两名学生只对自己所做的实验过程和结果进行 分析，按照研究论文形式写出实验报告。 实验中尽可能了解其他同学的实验过程和实 验结果，如果可能结合起来一起进行分析。 采用四人一组，每两人选择两个化合物进行测 试。因为每个实验由10个点构成，可以去掉几 个点得到比较理想的曲