chfr基因在急性白血病骨髓细胞中表达的研究(1)

ChfrChfr 基因在急性白血病骨髓细胞中表达基因在急性白血病骨髓细胞中表达 的研究的研究(1)(1) 作者：龚辉，刘文励，周剑峰，冉丹，徐慧珍 【摘要】为了探讨急性白血病（AL）患者骨髓细胞中 有丝分裂早期检查点 Chfr 基因的表达及其意义，对 46 例 初诊未治疗的 AL 患者骨髓单个核细胞，用 RT-PCR 和免疫 组织化学的方法检测 Chfr 基因 mRNA 及蛋白的表达，并与 正常人骨髓单个核细胞进行对照。结果表明：免疫组织化 学和 RT-PCR 分析显示，28 例急性髓细胞白血病（AML）中 的 15 例，18 例急性淋巴细胞白血病（ALL）中的 13 例骨髓 单个核细胞 Chfr 基因 mRNA 和蛋白的表达与正常对照相比 显著下降，同时 Chfr 基因表达异常病例染色体检查存在核 型异常。结论：急性白血病骨髓细胞有丝分裂检查点 Chfr 基因表达受损，可能在白血病发病中具有重要作用。 【关键词】急性白血病 AnalysisofExpressionofMitosisCheckpointGeneChfrinBo neMarrowCellsofAcuteLeukemiaPatients AbstractThisstudywaspurposedtoinvestigatethesignifi canceofmitosischeckpointgenechfrexpressioninacutele ukemia.2mlofbonemarrowwereextracted fromeachof46ALpatientsand10normaldonorsascontroland theirmononuclearcellswereisolated.Then，theirchfrex pressionwasdetectedbyusingRT- PCRandimmunohistochemistry.Normalcontrolbloodsample swerealsoanalyzed.Theresultsshowedthatin15outof28ca sesofacutenon- lymphocyticleukemiaand13outof18casesofacutelymphocy ticleukemiaexpressionofchfrgenemRNAandproteinsignif icantlydecreasedascomparedwithcontrol.Thecytogeneti canalysisofpatientswithadecreasedChfrexpressionreve aledabnormalchromosome.Inconclusion，Chfrgeneisaleu kemia- relatedgeneandmayplayanimportantroleinleukemiapatho genesis. Keywordsacuteleukemia；mitosischeckpoint；Chfrgene ；bonemarrowcell 细胞在长期进化过程中发展出了一套保证细胞周期中 DNA 复制和染色体分配质量的检查机制，通常被称为细胞周 期检查点（checkpoint） 。后者也称 M 期检查点。既往对 G2/M 期检查点的研究较多，而对 M 期检查点研究较少，特 别是以前发现的所有有丝分裂检查点基因 （mitosischeckpointgene）都不能很好地解释其与癌症发 生之间的关系，Chfr 是 Scolnick 等1于 XX 年发现的一 个 M 前期检查点基因，定位于。细胞存在有丝分裂应激时， Chfr 通路激活延迟染色体凝集。目前认为 chfr 基因可能控 制着最初的癌变过程，有作者2-4相继证实，Chfr 基因 与肿瘤相关，但与人急性白血病发病之间的关系目前不清 楚。我们分析了 46 例急性白血病患者骨髓单个核细胞中 Chfr 基因的表达及可能的作用。 材料和方法 细胞系与病例 白血病细胞系 HL-60 由同济医院肿瘤生物医学中心马 丁教授惠赠。培养于含 10小牛血清的 RPMI1640 培养液， 置 37，5CO2 培养箱中培养。46 例 AL 患者骨髓细胞标 本来自本院血液内科住院初诊未治疗患者，诊断按张之南 主编血液病诊断及疗效判断标准 。其中 AML28 例， ALL18 例，男 24 例，女 22 例，中位年龄 32 岁。按标准方 案化疗判断疗效，分 A、B 两组，A 组为部分缓解及未缓解， B 组 为完全缓解。10 例正常人骨髓来源于异基因骨髓移植 的正常供者。 RNA 提取及 RT-PCR AL 患者于治疗前抽取骨髓 3ml，肝素抗凝，用 Ficoll 分离液分离出 BMMNC。取 BMMNC（1106）细胞，应用 TRIZOL 试剂盒提取细胞总 RNA，用 AMV 逆转录试剂盒合成 cDNA，在 20l 总反应体积中含 3l 总 RNA，42孵育 1 小时，65灭活 AMV5 分钟，-20保存。RT-PCR 试剂盒购 自华美公司；PCR 标准参照物。TRIZOL 试剂购自 Gibco 公 司。PCR 同时扩增 Chfr 和 GAPDH，引物序列：参考文献 5并核对 GeneBank 原始 cDNA 序列，经上海博亚生物工 程公司鉴定并合成。Chfr：5-GGCGAGCGTTCCTCCAGTTG- 3，5-GCATGTCAGCGTCTCCTCCATCTTG-3，产物 306bp；GAPDH:5-ACGGATTTGGTCGTATTGGG-3，5- TGATTTTGGAGGGATCTCGC-3，产物为 260bp。在 50l 扩增 体系中含 cDNA3l、10buffer5l、Mg24l，1ldNTP，Chfr ，GADPH 的上、下游引物 50pmol/L。于 94预变性 5 分钟， 加入 1lTaq 酶，PCR 循环：94变性 60 秒，60退火 60 秒，721 分钟，共 40 个循环。每次扩增用 HL-60 细胞作 阳性对照，并设立阴性对照。产物鉴定，取产物 10l，2琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下读结果并照相，胶 片在凝胶成像系统中分析，以见到 Chfr 相应的扩增带为阳 性表达，并以每条带面积乘以灰度作为表达量。在各样本 之间以 Chfr/GAPDH 比值相比较。 Chfr 蛋白水平表达的免疫组织化学方法检测 羊抗人 Chfr 多克隆抗体（购自美国 SantaCruz 公司） 的工作稀释度为 1400，免疫组织化学试剂盒购自北京中 山生物公司。免疫组织化学法染色，HL-60 细胞系为阳性对 照，以 PBS 代替一抗为阴性对照。在油镜下看多个视野， 共计数 200 个细胞，以细胞核出现黄色或棕黄色细颗粒为 阳性细胞，细胞核被苏木精复染为蓝色被认为是阴性细胞， 阳性细胞的比例 白血病细胞染色体制备及核型分析 将白血病患者骨髓细胞 2106/ml 的密度接种于含 20小牛血清的 RPMI1640 培养液中，置于 37温箱中培养 24 小时，然后加入终浓度为 g/ml 的秋水仙酰胺，37孵 育 1 小时后收获细胞。按照本实验室常规 R 显带法分析核 型5 。核型异常按人类细胞遗传学国际命名体制 （ISCN1995） 6加以描述。 统计学处理 RT-PCR 数据用 xSD 表示，经 SPSS 统计软件分析，免 疫组化结果采用秩和检验分析。 结果 BMNC 中 Chfr 基因的 mRNA 表达水平 A、B 组 Chfr 的表达结果经统计检验分析显示，A 组与 正常对照组相比，无显著性差异（t=，P=)；B 组与正常对 照组相比，有显著性差异（t=，P=） （表 1） 。28 例 AML 中 14 例的 Chfr 基因表达与正常对照组相比