细胞工程部分章节重点总结归纳

第四章细胞培养技术第四章细胞培养技术 1,1,细胞培养细胞培养(Cell(Cell Culture)*Culture)* 是指从生物体内取出组织或细胞，在试管和培养平皿内模拟体内生理环境模拟体内生理环境，于无菌、适当温度无菌、适当温度 和一定营养条件和一定营养条件下，使之保持一定的结构和功能，以便于我们观察、研究的培养技术 二，培养细胞的生物学特征二，培养细胞的生物学特征 2，细胞生长方式细胞生长方式* 贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长的细胞生长方式 悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面的细胞生长方式 半悬浮生长：某些特别的细胞 3 3，细胞类型，细胞类型* 贴附型细胞*(Anchorage-dependent cell)：多呈上皮样或成纤维细胞样，正常细胞正常细胞具有 接触抑制和密度抑制的特性。 1.上皮细胞型(Epithelium)：扁平、不规则多角，彼此紧密相连，单层；如：来源于外 胚层、内胚层的细胞 2.成纤维细胞型(Fibroblast)：梭型、不规则三角或多角型，具短突起；如：来源于中 胚层细胞 3.游走细胞型(Wandering)：有伪足或突起，可游走或变形运动，散在生长；如：阿米 巴样神经胶质细胞 4.多形细胞型(Polymorphic)：多角型具长神经纤维；如：神经元细胞 悬浮型细胞*(suspending cell)：大多取自血液、脾或骨髓的培养细胞 多为圆型；如：淋巴细胞、白细胞、某些肿瘤细胞 4 4，培养细胞的生长特点：贴壁、接触抑制、密度抑制。，培养细胞的生长特点：贴壁、接触抑制、密度抑制。 1）接触抑制(Contact inhibition)*： 细胞在贴壁生长过程中，随着细胞分裂，数量不断增加，最后形成一个单层，此时细胞间相互 接触，发生细胞生长和移动抑制的现象称接触抑制（即贴壁细胞生长一旦相互汇合接触，即停 止移动和生长的现象） 。是区别正常细胞与癌细胞标志之一。 2） 密度抑制*(Density inhibition)： 细胞密度达到一定程度，培养液因营养消耗、代谢产物累积，导致细胞分裂停止 5 5，细胞周期概念（，细胞周期概念（cellcell cyclecycle） * 是指一个母细胞分裂结束后形成的子细胞开始至下一次,再分裂结束形成 2 个子细胞终止所经历 的全过程。 Or 是指细胞从第一次分裂结束产生新细胞到第二次分裂结束所经历的全过程，可分为间期和分 裂期（M 期） 。 细胞周期 = 分裂间期+分裂期 = G1 期 + S 期 + G2 期 + M 期 6，体外培养细胞寿命的过程分为三个阶段*：原代培养或初代培养期、传代期、衰退期 7，每代细胞的生长过程每代细胞的生长过程*每代分为三个阶段：注意与细胞系生长的异同 潜伏期(latent phase)：24-96h 指数生长期：一般 2-5 天，又称对数期(logarithmic growth phase) 平台期(Plateau phase)：又称生长停止期(Stagnate phase) 传代*：当细胞增殖到一定程度，将细胞分开接种到多个新的培养瓶，使之继续培养称传代。 8，每代细胞生长特点每代细胞生长特点* 潜伏期：贴壁、恢复阶段，增殖极慢 指数增生期： 细胞增殖旺盛，成倍增长。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长是否旺盛 2 的一个重要标志 通常以细胞分裂相指数细胞分裂相指数(Mitotic(Mitotic index,index, MI)MI)表示，即细胞群中每 1000 个细胞中的分 裂相数 指数增生期的细胞活力最好细胞活力最好，是进行各种实验最佳时期实验最佳时期，也是冻存细胞的最好时机冻存细胞的最好时机 停滞期或平台期： 细胞长满瓶壁后，细胞活力低、不再分裂，不及时传代，细胞脱落、死亡 9，生长曲线生长曲线(Growth(Growth curve)*curve)* 每次传代接种后，细胞的这些生长增殖过程，若进行检测计数，绘制成曲线，叫生长曲线。 各细胞的生长曲线各具特点，是该细胞生物学特性的指标之一。 10，体内外细胞的差异与分化体内外细胞的差异与分化* * 体内外细胞的差异体内外细胞的差异 体外培养细胞失去原有组织细胞形态，分化减弱或不明显 体外培养细胞功能变化：功能单一，出现衰老、转化现象 体外培养细胞出现环境适应现象，形态、功能出现相应改变 体外细胞的分化体外细胞的分化 体内外细胞分化表现不同，体外培养细胞的分化表现与组织来源明显相关 三，细胞的基本培养技术三，细胞的基本培养技术 11，原代培养原代培养 原代培养概念原代培养概念*：即从供体获取组织后的首次培养 特点：1）细胞生物学特性未发生很大变化，最接近和反映体内生长特性，适合作药物测试和细 胞分化等实验研究； 2）原代培养的细胞生长比较缓慢，而且繁殖一定的代数后停止生长，一般不超过 60-70 代 12，原代培养步骤原代培养步骤 组织取材组织取材 组织细胞的分离组织细胞的分离*： 1mm3 组织块，仅周边少数细胞可穿过组织束缚，获得生长。组织块越小，爬出的细胞越多 组织分散方法：机械法、消化法（胰蛋白酶法；胶原酶法） 1)1)细胞培养：细胞培养：单层细胞法（常用） 、悬浮细胞法（适于悬浮生长的细胞） 、组织块法（简便、 长出细胞的量较少） 、 1313，贴壁细胞传代方法，贴壁细胞传代方法* 1)吸尽培养瓶中的培养液，PBS 洗一次 2)加入胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准)静置 2-10 min (显微镜下动态监测) 3)吸去胰蛋白酶液，加入培养液 4)加细胞于离心管，低速离心，沉淀细胞 5)加少许培养液，吸管吸取瓶内培养液，轻轻吹打细胞，形成细胞悬液 6)吸取细胞悬液，接种于新的培养瓶内 7)加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。将后者放入培养箱中培养 四，细胞计数与活力测定细胞计数与活力测定 1414，细胞活力测定，细胞活力测定* *： 是测定体外培养细胞中死、活细胞组成的方法，是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一 15，克隆形成率克隆形成率用来表示细胞群体的依赖性和增殖能力。 五，细胞系和细胞株细胞系和细胞株 16，细胞系（细胞系（cellcell lineline）的概念）的概念*： 原代培养物经首次传代成功即称为细胞系，细胞系可泛指一般可传代的细胞 细胞工程部分章节重点总结归纳 10检生学委：王晓静 2012年12月12日 3 1717、细胞株、细胞株(Cell(Cell strain)*strain)* 细胞株概念： 1)通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物具有特殊性质或标志物的细胞称为 细胞株 2)细胞株是用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成单细胞增殖形成的细胞群。 特点：细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在 1818，符合细胞系，符合细胞系( (或株或株) )的条件的条件* 1)组织来源组织来源： 说明供体所属物种；年龄；性别；取材组织、器官；肿瘤组织还需：临床病理诊断，病历号 2)2)生物学检查：生物学检查： 细胞的一般或特殊性状：形态、特异结构、生长曲线、分裂指数、倍增时间；特异性：是否有 特殊产物；癌细胞的软琼脂实验、致瘤性、浸润性 3)培养条件和方法培养条件和方法：培养基、血清种类及用量、pH 19，细胞系细胞系( (或株或株) )的鉴定的鉴定* * 1）鉴定指标：纯度；细胞学特性；稳定性；污染情况 2）鉴定方法：形态学：光镜、电镜；细胞生长曲线法；核型分析；同工酶酶谱检查 3）细胞档案资料：完整的档案 六、细胞的冻存、复苏和运输细胞的冻存、复苏和运输 20，细胞冻存要点细胞冻存要点* 冷冻过程要缓慢冷冻过程要缓慢。需要冷冻保存的细胞先在 4冰箱中放置 3060 分钟；然后转入-20， 放置 30 分钟；然后再转入-80放置 1618 小时(或过夜)；最后放入液氮中长期保存 若用程控降温仪，按每分钟-1-3速度降温，一直到-80以下，然后直接放入液氮中 长期保存 21，低温保护剂的应用 在细胞冻存时加入低温保护剂，以保护细胞在冷冻过程中免受冰晶破坏 常用的低温保护剂*是 DMSO(DMSO(二甲基亚砜二甲基亚砜)，使用终浓度为 5-10%(常用 10%) 其它冷冻保护剂，如甘油(Glycerol),羟乙基淀粉等 2222、细胞冻存方法、细胞冻存方法* 预先配制冻存液： 含 20%血清培养基+10% DMSO，4保存(条件许可：90%血清+10%DMSO) 取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液 (11065106 细胞/mL) 加入 1mL 细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期 1 年后，存活率可达 80%-90%DMSO 液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞 23、冷冻细胞复苏及步骤冷冻细胞复苏及步骤* 1 1）细胞复苏）细胞复苏：按一定复温速度，将冻存细胞悬液由冻存状态恢复到常温 2 2）细胞复苏的步骤：）细胞复苏的步骤： 从液氮中取出冷冻管，迅速迅速投入 3738 水浴中，使其融化（1 分钟左右） 5 分钟内用培养液稀释至原体积的 10 倍以上 1000rpm，低速离心 3 分钟 去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞 2424、细胞冻存和复苏的原则：、细胞冻存和复苏的原则：慢冻快融慢冻快融* 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高， 并在细胞内形成冰晶 4 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，结晶就大，大 结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成 大冰晶，即冰晶的重结晶 而重结晶在 0发生，因此速融的最主要目的是让细胞迅速地通过 0危险期 25、细胞的运输充液法*： 选择细胞生长至 1/3-1/2 瓶底，补充新的培 养液，保留微量空气，密封运输。4-5 天可贴身运 输，或特快专递 26、你用什么技术指标阐述细胞增殖的特点？ 流式细胞：细胞周期 S-phase,；细胞计数：生长曲线；MTT（四唑盐）：细胞活力 第七章胚胎干细胞与诱导性干细胞第七章胚胎干细胞与诱导性干细胞 1 1，干细胞的基本概念，干细胞的基本概念 细胞是具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体 2 2，胚胎干细胞，胚胎干细胞 (embryo(embryo stemstem cellcell , , ESC)ESC)：由胚胎内细胞团或原始生殖细胞经体外抑制培养 而筛选出的细胞，具有发育全能性、体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。 3.ESC3.ESC 的的 2 2 大来源大来源：ES 细胞（EmbryonicEmbryonic StemStem cellscells） 和 EG 细胞：胚胎生殖细胞( embrionic germ cell ) 。 4 4、ESCESC 的生物学性质的生物学性质 细胞形态结构及核型、细胞的高度分化潜能、碱性磷酸酶的表达、胚胎阶段特异性细胞表面抗 原的表达 5 5、 ESES 细胞的鉴定：细胞的鉴定：细胞的形态结构、核型分析、碱性磷酸酶（AKP）染色、SSEA-I 免疫荧光 标记、分化能力检测 6 6、 iPSiPS 细胞（诱导多功能干细胞）：细胞（诱导多功能干细胞）：借助基因导入技术将某些特定因子导入动物或人的体细 胞，同时可选择性地在培养液中加入特定的小分子物质，即可将体细胞重编程为多潜能干 细胞，此类细胞在克隆形态、生长特性、表面标志物等方面与 ES 细胞非常相似 7、 从维持干细胞多能性的 24 个转录因子中筛出四个明星转录因子 ：Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc. 8 8，简述，简述 ipsips 细胞技术流程细胞技术流程 提取细胞、注入基因、改造成功、培育器官 成体干细胞及组织工程学成体干细胞及组织工程学 1 1，成体干细胞（，成体干细胞（somaticsomatic stemstem cellcell oror adultadult stemstem cellscells ） 指存在于分化组织中的未分化细胞，具有自我更新、构建和补充相应组织中各种类型细胞 的潜能。成体干细胞存在于机体的各种组织器官中。 2 2， 主要的成体干细胞有：主要的成体干细胞有： 造血干细胞（hematopoietic stem cell, HSC） 、骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell, MSC） 、神经干细胞（neural stem cell, NSC） 、表皮干细胞（epidexmis stem cell, ESC） 、脐 血干细胞（cord blood stem cell） 、肿瘤干细胞（cancer stem cell） 3、在肿瘤细胞中存在着小部分的肿瘤干细胞（cancer stem cells, CSCs） ，是肿瘤形成、复发、 转移和耐药的决定性原因和基础。 4 4、 成体干细胞三大特征：成体干细胞三大特征： 自我更新 、种系定向分化能力（具有多能分化特性，能够分化为特定组织的多种细胞类型，但 分化潜能有限） 、在特定组织定居（大多数成体干细胞处于休眠状态（G0 期） ，病理因素或诱导 后表现再生和更新能力，替代受损细胞或死亡细胞） 细胞工程部分章节重点总结归纳 10检生学委：王晓静 2012年12月12日 5 5 5、造血干细胞（、造血干细胞（HSCHSC）特性：）特性： 多向分化潜能、自我更新、当机体需要时，其中一部分 HSC 分化成熟，另外一部分则进行分化 增殖，以维持造血干细胞的数量相对稳定。 第八章核第八章核 移植技术与动物克隆移植技术与动物克隆 1 1，克隆克隆 (Clone)(Clone) *有两个方面的含义：一是指用无性方式进行无性繁殖的技术。二是指经 过无性方式繁殖所得到的后代群体。 2 2，克隆的生物范畴（主要类型），克隆的生物范畴（主要类型）：分子克隆、细胞克隆、动物克隆。 一，核移植技术（一，核移植技术（NuclearNuclear transfertransfer） 3 3、概念概念*：就是利用显微操作技术将一个细胞的细胞核移植到另一个细胞中一个细胞的细胞核移植到另一个细胞中，或将两个细 胞的细胞核（或细胞质）进行交换，从而可能创造无性杂交生物(新品种)的一项技术。 4 4、 核移植技术的类型及其优点核移植技术的类型及其优点 核移植技术的类型 胚胎细胞核移植胚胎细胞核移植（胚胎）干细胞核移植（胚胎）干细胞核移植体细胞核移植体细胞核移植 优点优点 分化程度低、分化 潜能大、核移植易 成功 体外培养寿命长、培养更方 便；分化程度低、分化潜能 大、核移植易成功 核供体为成体体细胞、 体细胞核全能性的恢 复 5 5、 以克隆羊以克隆羊“多莉多莉”的诞生为例阐述核移植技术的一般操作流程的诞生为例阐述核移植技术的一般操作流程 概念：概念：核移植技术就是利用显微操作技术将一个细胞的细胞核移植到另一个细胞中，或将两个 细胞的细胞核（或细胞质）进行交换，从而可能创造无性杂交生物(新品种)的一项技术。 其一般流程为其一般流程为： 苏格兰黑面母羊 A（卵细胞供体）去除卵细胞核的，得去核卵细胞 白色芬兰母羊（体细胞供体）提取的乳腺细胞放于一种培养液中培养数天取出细胞核乳 腺细胞中的双倍体核植入去核卵细胞中电脉冲融合（为一个包含了体细胞核的卵细胞）移 入休情期的苏格兰黑面母羊 B 结扎的输卵管内培养，发育至 8 细胞胚将其植入苏格兰代孕黑 面母羊 C 的子宫发育苏格兰代孕黑面母羊 C 产下一只小羊羔（即克隆羊“多莉” ） “多莉多莉”的意义的意义：促进生物学和医药的研究获得更多的优秀动物个体可以复制生产高价 药物的动物 【克隆的一般流程：1.获得“供体细胞的细胞核”：早期胚胎细胞、成体体细胞； 2. 获得无 核卵母细胞。3. 将目标细胞核经显微手术移植到去核卵母细胞中 4. 适当的条件下，重新发育 成正常胚胎。5. 胚胎被移植到适当母体中，获得与供核个体遗传性状已知的个体。 】 6、克隆羊多莉的重要生物学意义克隆羊多莉的重要生物学意义*： 第一、它证明了：一个已经完全分化了的动物体细胞核仍然保持着当初胚胎细胞的全部遗传 信息分化了的体细胞具有再分化的全能性（可恢复发育过程中失去的全能性）遗传物质是 可逆变化的 第二、多利的成功提示：在培育体细胞成为核供体之前，利用“基因靶”技术精确地植入外 源目的基因，诱发核基因的遗传改变再用选择技术准确地挑选那些含目的基因的细胞作为核 供体，从而生产出基因克隆体。 第三，多莉羊的诞生标记：人类可以对基因进行有规律地控制而解决更多的问题利用克隆 技术复制哺乳类动物的最后技术障碍已被突破，在理论上已成为可能。 7、哺乳动物核移植技术的主要操作程序哺乳动物核移植技术的主要操作程序* (1) 核受体的处理和制备(2) 核供体的处理和制备(3) 细胞核移植(4) 重组核的激活(5) 重组 胚的体外或体内培养(6) 核移植胚胎移入代孕母畜（即胚胎移植） 8 8、去核卵母细胞常常作为核移植的受体细胞。 供体细胞类型：供体细胞类型：胚胎卵裂球细胞、体细胞、胚胎干细胞和胎儿成纤维细胞 6 细胞核移植的方法有透明带下注射、胞质内注射 胚胎移植胚胎移植：受体母畜的选择：皮毛颜色与供体品种不同、繁殖性能强、体格稍大的当地品种 移植部位：输卵管、子宫角移植方法：同期发情处理、常规法移植 二、核移植技术的应用二、核移植技术的应用 9 9、治疗性克隆、治疗性克隆*(Therapeutic*(Therapeutic cloning)cloning)：利用核移植技术与转基因和胚胎干细胞等生物技术 结合，体外培养所需细胞、组织器官、以替代或修补患者损伤或患病的细胞、组织、器官的过 程 1010、核移植的主要应用核移植的主要应用( (框架式框架式) )，并举，并举 1-21-2 例例: : 制备转基因克隆动物， 进行生物药物生产 培育优良畜种，扩大良种种群开展异种动物克隆，拯救濒危动物与干细胞技术结合，开 展治疗性克隆利用核移植技术，研究生物学的基本问题 第九章第九章 转基因动物与动物生物发生器转基因动物与动物生物发生器 一、转基因动物的培育技术转基因动物的培育技术 1、概念：转基因动物概念：转基因动物*(transgenetic*(transgenetic animal)animal) 将特定的目的基因从某一生物体分离出来，体外进行扩增和加工，导入另一动物的早期胚胎细 胞中，使其整合到宿主动物的染色体上，当胚胎被移植到代孕动物体内后，在发育过程中稳定 表达或诱导表达，并通过生殖