组织蛋白酶b抑制剂的药物研究

组织组织蛋白蛋白酶酶 B 抑制抑制剂剂的的药药物研究物研究 郝郝伟丽伟丽 1 林 林洁洁 2范玉玲 范玉玲 2路新 路新华华 2 （1.河北师范大学生命科学学院，河北 石家庄 050016；2.华北制药集团新药研发有限责任公司，河北 石家庄 050015） 摘要摘要：目的目的 对Cathepsin B（catB）抑制剂药物的研究概述。方法方法 以近年来国内外相关文献为依据，进行分析 归纳。结果与结论结果与结论 catB是一个丰富而广泛表达的半胱氨酸蛋白酶，在许多生理和病理过程中发挥重要作用。 进一步研究开发新的catB抑制剂药物，具有广阔发展前景。 关键词关键词：组织蛋白酶B；抑制剂；半胱氨酸蛋白酶；抗癌药物 中图分类号：文献标志码：文章编号 Abstrat OBJECTIVE To investigate and summarize drugs of Cathepsin B（catB） inhibitors. METHODS By analysis and summarization, according to the related literature domestic and abroad for the past few years. RESULTS AND CONCLUSION catB is an abundant and ubiquitously expressed cysteine proteinase, and plays very important roles in many physiological and pathological processes. It will take on a broad development perspective to research new drugs of catB inhibitors. Key words Cathepsin B, inhibitors, cysteine peptidase, anticancer drugs 1.1. 前言前言 组织蛋白酶（Cathepsin，cat）是一大类主要存在于溶酶体的半胱氨酸蛋白水解酶，因 催化中心不同而分为不同类型，组织蛋白酶 B，C，K，L，M，N 和 S 等属于半胱氨酸蛋 白酶，组织蛋白酶 A，G 和 R 属于丝氨酸蛋白酶，组织蛋白酶 D 和 E 属于天冬氨酸蛋白酶 1。 图 1 人类CB的X-射线结构图 Fig.1. X-ray structure of human catB 组织蛋白酶B（catB，EC 3.4.22.1）在肝、脾、肾、骨、神经细胞、间质成纤维细胞、 巨噬细胞等都有分布，以酶原的形式贮存在溶酶体中。正常情况下，约10的酶原被生理 性分泌至胞浆，被其他的蛋白水解酶水解或自身激活，切除N端和C端多余的氨基酸残基形 成活性形式，参与许多特殊的生理过程，如激素原的激活、抗原呈递、组织器官发育等。 catB具有广谱蛋白水解酶活性2，水解位点为-Arg-Arg-/ -Xaa，在pH 3.07.0 都有活性， 酸性条件下有外肽酶活性，中性pH下有内肽酶活性，碱性条件下会不可逆失活。 根据X-射线衍射结构图（图1） ，整个catB结构可分为L-，R-两个结构域3（图2） ，活性 位点和底物结合位点位于这两个域的界面。底物在catB活性位点的插入，受18个残基组成 的闭合环状结构控制。这个闭合环状结构也是catB区别于其他木瓜蛋白酶的特征，它提供 了2个His残基，以结合到底物的C末端羧基上。闭合环形状是可变的，其稳定性与catB所处 环境的pH有关。在溶酶体的酸性环境中，catB活性位点是闭合环状结构，catB为肽链外切 酶，但当pH值升高，闭合环状结构被打开，而成为肽链内切酶。 图 2 底物插入到catB活性位点示意图 Fig.2. Schematic of the binding of a substrate to the active site of catB 2.2. catBcatB 的病理功能的病理功能 如上所述，catB 具有双重蛋白水解活性，这使之能参与多种基底膜蛋白如层粘连蛋白， 纤维连接蛋白，型胶原蛋白的降解，继而破坏一系列组织屏障，为癌细胞的移动打开通 道，促进肿瘤细胞向深部组织浸润，参与肿瘤的发生和转移，并与肿瘤的复发有明显相关 性4。肿瘤细胞可分泌 catB，该分泌型的 catB 由于缺乏甘露糖-6-磷酸受体识别标记，故 不能被摄入溶酶体，而多以酶原的形式存在于胞浆和细胞外5。由于肿瘤细胞能够酸化其 周围的环境，其分泌的 catB 在此环境中活化，同时在中性及碱性环境中活性不受影响，甚 至增高，因此癌组织匀浆中 catB 活性远高于远离癌肿的正常组织中 catB 的活性6，这可 作为癌细胞恶性表型-浸润转移的一种指标。活化的 catB 除了自身参与胞外基质成分的降 解外，还能激活蛋白水解级联反应，最终生成能够降解多种胞外基质成分的物质。 病理状态下，各种原因所致的细胞损伤(如病原微生物、炎症因子、氧化应激等)，导 致溶酶体膜稳定性降低、通透性增高甚至破裂，大量 catB 释放到胞浆或组织间隙，并被激 活，介导细胞炎症性坏死及发生凋亡，与人类许多疾病如肿瘤的浸润与转移、关节炎、骨 质疏松、Alzheimer 病、多发性硬化症及其他急慢性炎症性疾病有关。因此抑制 catB 活性 已成为相关疾病治疗的重要措施。 3.3. catBcatB 抑制剂药物研究抑制剂药物研究 因为高的catB活性是癌症发展的重要特征，因此使用catB抑制剂可以减少肿瘤转移和 侵袭水平，这在许多体外实验中都得到了验证，动物实验证明选择性catB抑制剂可减少肝 损害7,也显示了其在肿瘤治疗中的潜力。 根据catB 抑制剂的来源，可将其分为内源性抑制剂、天然来源的抑制剂和合成抑制剂； 还可根据抑制机制不同，分为可逆的抑制剂和不可逆的抑制剂。下面将分别描述。 3.1.1 内源性 catB 抑制剂 迄今为止，已经发现了大量的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，形成一个超家族。其中最丰富 和特征性的内源抑制剂可细分为4个家族，stefins，西司他汀类和激肽原这三者是真正意义 上的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，第四类家族在结构上与这个超家族具有一定的同源性，但不 具备抑制半胱氨酸蛋白酶所必需的三个功能位点。所有的半胱氨酸酶抑制剂都是竞争的， 可逆的，与底物紧密结合，抑制水平从mmol到pmol不等。 3.1.2 天然来源的 catB 抑制剂 从土壤生物中已经分离到三种自然来源的组织蛋白酶抑制剂，醛基肽、氮丙啶肽和环 琥珀酸肽。这些抑制剂一半是非选择性的，因为木瓜蛋白酶家族有相似的三维结构，相似 的底物特异性。 氮丙啶类抑制剂miraziridine8和醛类抑制剂的tokaramide A9，由海绵Theonella mirabilis中分离得到，对catB的IC50分别为1.4g/mL，29ng/mL。许多潜在的醛类抑制剂也 从strepiomyces菌株不同培养物中分离到，酶醛肽是其中最有潜力的catB抑制剂，IC50为 9.2ng/mL10；从streptomyces spQ21705中分离到的YM-51804，对catB的IC50为12.0nM11。 最系统研究的poxysuccinyl肽类成员是从Aspergillus japonicus中分离得到E-64（图3），对 catB，catL和木瓜蛋白酶的IC50分别为55nM，68nM和580nM12。 图 3 poxysuccinyl类抑制 Fig.3. poxysuccinyl inhibitors 黄酮类化合物也显示出很强的catB抑制活性。穗花杉双黄酮，4-methylamentoflavone 和 7，4-dimethylamentoflavone 可以从许多植物中分离得到，它们对catB的IC50低于 mmol水平（图4）13。 图 4 天然来源的黄酮类catB抑制剂结构及其IC50 Fig.4. structure of the natural flavonoid catB inhibitor, with their inhibitory activities 从海绵动物体内的Asteropus simplex菌发酵产物中分离到一个新的蝶啶衍生物14， Asteropterin（图5），这是一个将2,4-二氧四氢蝶啶和N-甲基组胺连接在一起的独特分子， 并具有catB 抑制活性，IC50为1.4g/mL。 图 5 Asteropterin Fig.5. Asteropterin 从海洋Pseudomonas sp.PB01的发酵产物上清里分离到两种catB抑制剂15，邻苯甲二 酸二丁酯和二-2-乙基己基苯二甲酸酯（图6），它们都是剂量依赖型catB抑制剂，IC50分别 为0.42mM，0.38mM。 图 6 邻苯甲二酸二丁酯和二-2-乙基己基苯二甲酸酯结构 Fig.6. structrue of dibutyl phthalate and di-(2-ethylhexyl) phthalate 3.1.3 合成 catB 抑制剂 从微生物发酵产物中分离catB抑制剂作为潜在的抑制剂药物研究的先导化合物9,16，或 者根据catB的巯基酶特性和特征性的闭合环状结构17来设计特异的catB抑制剂，是合成 catB 抑制剂药物研究的切入点。此外，大分子抑制剂和catB之间形成的复合物的X射线晶 体结构信息也可作为小分子化合物合成的依据18。 3.2.1 不可逆catB抑制剂 （1）环琥珀酸肽类catB抑制剂 此类化合物代是最广泛研究的catB抑制剂，代表性的是E-6419。在结构-活性研究中发 现，这些环氧环上的自由羧基取代物是此类化合物对半胱氨酸蛋白酶选择性的关键因素20， 如果环上包含一个酯或酰胺取代物，同时C-末端有自由羰基取代物（可与His110和111残基 反应），则可提高其对catB的选择性21,22。一系列环氧琥珀酰类的衍生物中，对catB选择 性较高的是CA074 (图3)，与E-64及其衍生物不同，其SS构型是优于RR构型的。 （2）氮丙啶类catB抑制剂 图7 氮丙啶类catB抑制剂母核 Fig.7. parent structure of arizidine catB inhibitors 环琥珀酸衍生物的合成包含一个氮丙啶-2，3-双羧基作为亲电子基团，与catB Cys29 反应。N端未取代的衍生物对catL的选择性更高23，而自由羧酸对氮丙啶环的攻击可以增 强一系列N-端未取代的氮丙啶类化合物的活性24,25。此类抑制剂也可以在N端质子化，因 此其抑制活性有极强的pH依赖性，在pH4.0的时候达到最大抑制效果。 （3）内酰胺类catB抑制剂 图 8 内酰胺类catB抑制剂 Fig.8. structure of -Lactam catB inhibitors 内酰胺核是抗生素和不可逆蛋白酶抑制剂的药效基团，虽然内酰胺类抑制剂对catB 的选择性不高26，但是可以通过对其C3，C4位点的修饰使这类化合物成为catB选择性的新 型抑制剂。 3.2.2 可逆 catB 抑制剂 可逆的抑制剂可以降低毒性，在疗效方面极为重要。可逆的、紧密结合的catB抑制剂 合成研究已经投入很多，但是只取得了有限的效果，因为对S和S位点只能在一个方向上 进行修饰而形成亲电子区域。 （1）醛类catB抑制剂 图 9 醛类catB抑制剂原理 Fig.9. principle of aldehyde catB inhibitors NMR研究证明，醛类抑制剂可通过其醛基与丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶的羟基形成四面 体结构来抑制蛋白酶（图9）27。尽管醛和肽之间是共价结合，这类抑制剂仍然是可逆的 抑制剂。过去的10多年里，已经合成了大量的醛类抑制剂，但极少有catB选择性的。最有 catB抑制剂潜能的，是图10所示结构化合物28。 图 10 最有潜力醛类catB抑制剂 Fig.10. the most potent aldehyde cruzain catB inhibitors （2）酮类catB抑制剂 图 11 环己酮类catB抑制剂一般结构 Fig.11. general structure of cyclohexanone catB inhibitors 酮类可与catB的Cys29反应，而成为潜在的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，但醛基一旦被氧化 成羧酸后，其抑制作用很快消失，以吸电子基团代替醛基，则可提高对半胱氨酸蛋白酶抑 制剂的选择性。Nagao等据此合成了一些对组织蛋白酶B有活性的吡咯酮类物质29。 （3）环丙烯酮类catB抑制剂 图 12 环己烯酮类 catB 抑制剂母核 Fig.12. parent structure of cyclopropenone catB inhibitors 环丙烯酮环具有两性特征30，既可作为亲电子物质，也可作为前体化合物而质子化形 成稳定结构，根据前者可设计可逆的catB抑制剂。环丙烯酮环与Cys29的巯基反应，也可以 被这个酸性的Cys29质子化。这类抑制剂和环琥珀酸衍生物有相似的几何特征，Ando等在 环丙烯酮结构上连接一个活化位点导向的肽链，对半胱氨酸蛋白酶表现出强烈抑制活性， 而对丝氨酸蛋白酶没有抑制活性31。 （4）腈类catB抑制剂 图 13 腈类catB抑制剂母核 Fig.13. parent structure of nitrile catB inhiitors 长期以来，腈被认作是半胱氨酸蛋白酶的抑制剂（图13）32。NMR研究显示这类化合 物与酶之间形成可逆的硫代亚胺型中间体，推测认为这个中间体与catB Cys29残基的-NH骨 架有关33。在结构基础上已经设计出了很多肽基腈类catB抑制剂，通过对P3和P2位点的 取代物进行系统和迭代优化，可使这类抑制剂对catB的抑制潜能提高1000倍。将羧基功能 域和-C结合到腈上，与catB的Cys29的His110和His111反应，可大大提高这类抑制剂对 catB的选择性34 4.4. 讨论讨论 catB半胱氨酸蛋白酶在许多生理和病理过程中发挥重要作用。在生理条件下，体内 catB及其抑制剂处于平衡状态，病理状态下这个平衡被打破，涉及许多疾病，如炎症，感 染，癌症等。catB的胞内外蛋白水解活性可降解细胞基质，从而为肿瘤侵袭和转移打开通 道。因此，抑制catB活性可大大降低肿瘤细胞的存活率和侵袭力，catB抑制剂被看作是潜 在的抗癌和抗转移试剂而给予厚望。但是，20多年的研究和发展几乎没得出临床前的数据， 也没有关于catB抑制剂在肿瘤治疗中的研究数据。 组织蛋白酶抑制剂应用前景看好，尤其catB，针对其作用特点，寻找相应的高效低毒 药物用于临床疾病的治疗，值得进一步研究、探索。最近研究发现，catB在病理过程较肿 瘤转移和侵袭方面有更重要的功能，因此除了抗癌药物，在其他疾病治疗方向上开发新的 以catB为靶点的药物将有重大意义。 参考文献 1 Lu Shiying, Ren Honglin, Liu Zengshan, et al. Development about research of cathepsin B, Transaction of Hebei normal university, 2004, 28(3): 306-309. 2 Vitot, Boris T, Dusan T, et al. Lysosomal cysteine proteases: Facts and opportunities J . The Embo J,2001, 20(17): 4629-4633. 3 TurkV, Turk B, CctmcarG, et al. Lys0s0mal cathepsins: structure, roleinantigen pmoe8siI1gand presentation JAdvan Enzyme, 2002, 42: 285-303. 4 Kuai Xiaoling, Xiao Shudong, Liu Wenzhong, et al, Establishment of cathepsin B Elisa, 2002, 7(6): 335-337. 5 Zeng, Guangzhi, Tan Ninghua, Jia Ruirui, Cathepsin and inhibitors research, Research of Yunnan plants, 2005, 27(5): 337-354. 6 Frohhch E, Schlagenhauff B,Mohrle M,et al. Activity, expression, and transcription rate of the cathepsin B, D, H, and L in cutaneous malignant melanoma. Cancer, 2001, 91(5): 972-982. 7 Z.Ben-Ari, E. Mor. D.Azarov, et al, Cathepsin B inactivation attenuates the apoptosis injury induced by ischemia/reperfusion of mouse liver. Apoptosis 2005, 10(6): 1261-1269. 8 Yoichi Nakao, Masaki Fujita, Kaoru Warabi, et al. Miraziridine A, a Novel Cysteine Protease Inhibitor from the Marine Sponge Theonella aff. mirabilis, J. Am. Chem. Soc. 2000, 122(42): 10462-10463. 9 Fusetani N, Nakao Y, Nakao Y, Tokaramide A,a new cathepsin B inhibitor from the marine sponge Theonella aff.mirabilis, Bio 35:583846. 12 Barrett AJ, Kembhavi AA, Brown MA, et al. L-trans-epoxysuccinyl-leucylamido(4-guanidino) butane (E-64) and its analogues as inhibitors of cysteine proteinases including cathepsins B, H and L. J Biochem. 1982, 201: 189198. 13 Pan XL,Tan NH,Zeng GZ,et al. Amentoflavone and its derivatives as novel natural inhibitors of human Cathepsin B. Bioorg Med Chem.2005,13: 5819-5825. 14 Greg Hook, Mark Kindy, Vivian Hook. Asteropterin, an inhibitor of catB, from the marine sponge Asteropus simplex. Tetrahedron Letters. 2008,49:4186-4188. 15 Van L.T.Hoang, Yong Li,and Se-K won Kim, Cathepsin B inhibitory activities of phthalates isolated from a marine Pseudomonas strain, Bioorg. Med. Chem.2008,18:2083-2088. 16 Lenarcic B, Krishnan G, Borukhovich R, et al. Saxiphilin, a saxitoxin-binding protein with two thyroglobulin type 1 domains, is an inhibitor of papain-like cysteine proteinases. J Biol Chem. 2000,275(20):15572-15577. 17 Petanceska S, Burke S, Watson SJ, et al. Differential distribution of messenger-RNAs for cathepsin B, cathepsin L and cathepsin S in adult rat brain: an in situ hybridization study. Neuroscience. 1994, 59:729-738 18 Turk B, Turk, D, Salvesen, Regulation cysteine protease activity: essential role of protease inhibitors as guardians and regulators. Curr. pharm. des. 2002, 8, 1623-1637. 19 Kos J, Lah TT. Cysteine proteinases and their endogenous inhibitors: target proteins for prognosis, diagnosis and therapy in cancer. Oncol Rep.1998;5:1349-1361. 20 Meara J.P., Rich D.H. Mechanistic studies on the inactivation of papain by epoxysuccinyl inhibitors. J. Med. Chem. 1996;39:33573366. 21 Turk, D., M. Podobnik, T. Popovic, et al. Crystal structure of cathepsin B inhibited with CA030 at 2.0-A resolution: a basis for the design of specific epoxysuccinyl inhibitors. Biochemistry. 1995,34:4791-4797. 22 Yamamoto A, Hara T, Tomoo K, et al. Binding Mode of CA074, a Specific Irreversible Inhibitor, to Bovine Cathepsin B as Determined by X-Ray Crystal Analysis of the Complex J. Biochem. 1997,121:974-977. 23 T Schirmeister, New peptidic cysteine protease inhibitors derived from the electrophilic alpha-amino acid aziridine-2,3-dicarboxylic acid. J Med Chem. 1994.42(4):560-572 24 Schirmeister, T., and M. Peric. Aziridinyl peptides as inhibitors of cysteine proteases: effect of a free carboxylic acid function on inhibition. Bioorg. Med. Chem. 2000, 8:1281-1291. 25 Martichonok V , Plouffe C, Storer A C, et al, Aziridine analogs of trans-(epoxysuccinyl)-L-leucylamino-4- guanidinobutane (E-64) as inhibitors of cysteine proteases. J-Med-Chem. 1995, 38(16): 3078-3085. 26 Zhou NE, Thomas G, Thomas G, 3-acylamino-azetidin-2-one as a novel class of cysteine protease inhibitors, Bioorg. Med. Chem .2003,13:139-141. 27 Lewis, C. A., Jr. and Wolfenden, R. Thio