第二十章 高效液相色谱法

第二十章 高效液相色谱法 一、内容提要 高效液相色谱法（HPLC）是在经典液相色谱的基础上引入气相色谱的理论和技术，并 加以改进而发展起来的一种高压、高效、高速、高灵敏度的色谱分析方法。其定量分析方 法与气相色谱法相同。 高效液相色谱仪由高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统和记录数据处理系 统构成。根据不同的分离对象常选择不同的固定相和流动相，常用的固定相为化学键合固 定相，流动相通常用恒流或梯度洗脱方式洗脱组成。其定量方法同气相色谱法。 本章重点是高效液相色谱法与经典液相色谱法和气相色谱法的比较，高效液相色谱仪 的组成及仪器操作注意事项；难点是定量分析方法。 二、习题 （一）判断题 （ F ）1高效液相色谱中的流动相是分析成败的关键，它直接关系到柱效和分离度。 （ T）2紫外检测器是 HPLC 中应用最普遍的检测器。 （T）3对于亲脂性试样的分离，合适的高效液相色谱类型为反相液液色谱。 （ T）4在高效液相色谱中，采用梯度洗脱可提高色谱的分离度。 （ T ）5在高效液相色谱中采用进样阀进样可以降低进样过程对整个系统的扰动。 （ F）6高效液相色谱仪，通常是直接在层析柱上进样的。 （ T ）7化学键合相，可克服固定液的流失。 （ T ）8HPLC 法中常用 较小的流动相。 （F）9化学键合相，对极强的酸具有很好的稳定性。 （ T ）10化学键合相的优点是耐溶剂冲刷。 （ F ）11高效液相色谱柱可以是任意形状的。 （二）单选题 1在高效液相色谱中，最常用的检测器是（A ） 68 A紫外检测器 B荧光检测器 C示差折光检测器 D电导检测器 E蒸发光散射检测器 2在高效液相色谱中，适用于紫外检测器作流动相最合适是（A ） A在波长 190nm 以上无吸收峰 B在波长为 254nm 以上无吸收峰 C在波长为 365nm 以上无吸收峰 D在波长为 280nm 处无吸收峰 E以上均非 3在高效液相色谱中，为了获得较高柱效能，常用的色谱柱是（A ） A直型柱 BS 型柱 CU 型柱 D螺旋形柱 E不规则型柱 4高效液相色谱与经典液相色谱的主要区别在于（ B ） A高温 B高效 C柱短 D上样量少 E流动相 5高效液相色谱与气相色谱仪比较，增加了 B ） A恒温器 B高压泵 C程序升温 D检测器 E自动进样器 6在高效液相色谱中，范氏方程中的哪一项对柱效的影响可以忽略不计（ D ） A涡流扩散项 B流动相的传质阻力项 C固定相的传质阻力 项 D分子纵向扩散项 E以上均非 7下列固定相，能用于高效液相色谱的是（C ） A硅藻土 B氟担体 C全多孔无定形 D玻璃微球 E硅石微 球 8利用高效液相色谱法对试样进行分离时，首先要选择的是（ D） A流速 B柱温 C柱压 D固定相 E检测器 9在高效液相色谱中，梯度洗脱适用于分离（D ） A几何异构体 B极性化合物 C分子量相差大的混合物 D分配比变化范围宽的复杂试样 E挥发性组分 10RPHPLC 法最常用的流动相体系是（B ） ACH3CH2OHH2O BCH3OHH2O CCH3COCH3H2O DCH3COOC2H5H2O ECHCl3(CH3CH2)2O （三）多选题 ACDE1在高效液相色谱中，二个溶质的分离度与下列哪些因素有关（ ） 69 A增加柱长 B改用更灵敏的检测器 C更换固定相 D更换流动相 E改变流速 ABC2 常用的 HPLC 法中色谱柱的规格是（ ） A10cm B15cm C25cm D35cm E45cm ABCE3高效液相色谱的特点是（ ） A高速化 B高效化 C高压化 D高进样量 E高灵敏度 ABCDE4高效液相色谱仪的主要组成系统是（ ） A高压输液系统 B进样系统 C分离系统 D检测系统 E数据处理系统 BC5高效液相色谱法对流动相的要求是（ ） A应与固定相有一定的互溶度 (与固定相不互溶) B其性能应与所用检测器相匹配 C对样品有足够的溶解能力 D应尽量选用低毒高粘度的溶剂，如乙 醇 E应尽量选用高沸点的溶剂以防止操作过程中溶剂挥发 ABD6HPLC 法中常用的检测器有（ ） AUVD BDAD CFID DELSD ETCD ABCE7下列关于 HPLC 仪中高压进样阀的叙述，正确的是（ ） A进样量准确 B重复性好 C可带压进样 D死体积小 E使用方便 ABCDE8化学键合相的优点是（ ） A使用过程不流失 B化学性能稳定 C热稳定性好 D载样量大 E适于作梯度洗脱 （四）填空题 1高效液相色谱法的分类，按固定相的聚集状态可分为 及 两大类， 按分离机制可分为 、 、 、 四种类型。 2高效液相色谱中的反相键合相色谱是一种流动相极性 固定相极性的分配色谱 方法，流动相的极性可在较大范围内调整，用于分离 、 等各种化合物。 （五）名词解释 1化学键合相 2梯度洗脱 （六）简答题 70 1高效液相色谱有哪些特点？ 2化学键合固定相有哪些优点? 3高效液相色谱对流动相的要求是什么？ 4高效液相色谱仪的系统组成操作注意事项？ 5全面比较高效液相色谱法和经典液相色谱法。 6全面比较高效液相色谱法和气相色谱法。 （七）计算题 用高效液相色谱法测定葛根素注射液中葛根素的含量。供试品溶液制备方法如下：精 密量取待测葛根素注射液 0.5mL 至 10mL 容量瓶中，加 NaOH 至刻度，摇匀，即得。在相 同色谱条件下将对照品与供试品各进样 10L，色谱峰面积分别为 2346785，2543272。已 知葛根素对照品的浓度为 0.05372mg/mL。葛根素的标示量是 1.2mg/mL，其标示量的合格 范围为 95105，试判断样品是否合格。 三、答案 （一）判断题 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 （二）单选题 1A 2A 3A 4B 5B 6D 7C 8D 9D 10B （三）多选题 1ACDE 2ABC 3 ABCE 4 ABCDE 5BC 6ABD 7ABCE 8ABCDE （四）填空题 1液液，液固，吸附，分配，离子交换，凝胶 2大于，弱极性，中等极性 （五）名词解释 略 （六）简答题 71 1答：高效液相色谱法的特点是适用范围广、分离效率高、速度快、流动相可选择范 围宽，灵敏度高，色谱柱可反复使用，流出组分容易收集，安全等特点。 三高二广一少 2答：化学键合固定相克服了固定相易流失的缺点，并且遇强酸不分解，在各种溶剂 中稳定性好，使用寿命长，可选用的流动相范围广，对热稳定，键合在担体表面上的有机 基团可根据试样的类型而改变，从而提高分离选择性。 键合固定相非常稳定，在使用中不易流失。键合到载体表面的官能团是各种极性的， 他适用于各种样品的分离分析，应用最广。 3答：在 HPLC 中，对流动相的要求是：（1）与固定相不互溶。 （2）不与固定相发 生化学反应。 （3）对样品要有适当的溶解度。 （4）必须与检测器相适应。 （5）溶剂的粘度 和沸点都要小。 （6）避免使用毒性大的溶剂 4答：高效液相色谱仪主要由六大系统组成，即（1）高压输液系统（2）进样系统 （3）分离系统（4）检测系统（5）温控系统（6）记录或数据处理系统构成。 5HPLC 与 LC 的比较 LCHPLC 1理论上 均可用塔板理论解释 相 同点 2分离机理 上 均有吸附，分配，离子交换，凝胶四种分离机理 1固定相颗 粒 全多孔无定形颗粒，30-200 目， 不均匀，不耐高压，在一定压力下 会破碎，会造成柱效降低 表面多孔形或全多孔微粒型，5- 10m，2500-2000 目，均匀，耐高 压 2操作压力 常压 1kg/cm2或低压 4-5 kg/cm2 40-200 kg/cm2或 500-4000psi 3柱效（n/ 米） 2-50103-104 4样品用量 1-10g10-5-10-4g 如 1000ng，5-20l 不 同点 5分析时间 1-24 小时甚至几个月10-60min 72 6装置 间断，非仪器化连续，仪器自动化，RSD30% 7柱长 05-2 米，粗，用一次 10-25cm，短，可重复使用（毛 细管除外） 6HPLC 与 GC 的比较 GCHPLC 1柱效均具有较高的柱效 2灵敏度均具有较高的灵敏度 相 同点 3分析速度均具有较快的分析速度 1流动相 气体，可压缩，扩散系数大， 粘度小 液体，不可压缩，扩散系数小， 粘度大 2流动相