原花青素的生化活性研究 毕业论文.doc

第 一 章前言原花青素(procyanldins，简称pc，其它曾用过的英文名有（proanthocyanidins,1eucoanthocyanidlns,lpycnogenol）是植物王国中广泛存在的一大类多酚化合物的总称。起初统归于缩合鞣质或黄烷醇类。随着分离鉴定技术的提高和对此类物质的深入研究与深刻认识，现已成为独树一帜的一大类物质并称之为原花青素。1961年，德国karl等从英国山楂crataegus oxyacantha新鲜果实的乙醇提取物中首次分离出2种多酚化合物；1967年，美国josiw等又从葡萄皮和籽提取物中分离出4种多酚化合物、他们得到的多酚化合物是无色的，在酸性介质中加热均可产生花青素(cyanidins)物质，故将这类多酚化合物命名为原花青素原花青素(procyanidins或proanthocyanidins,pc.)存在于许多植物的叶、花、果、皮中，且以皮中含量最高。是由黄烷-3-醇或黄烷-3.4-二醇及其酯以不同的聚合度聚合而成，原花青素化学结构是由不同数量的儿茶素或表儿茶素结合而成。最简单的原花青素是儿茶素与表儿茶素形成的二聚体，此外还有三聚体、四聚体等直至十聚体。按聚合度的大小分类，通常将二-四聚体称为低聚体(procyanidolic o1igomers、简称opc， s)、将五聚体以上的称为高聚体(procyamdolic polymers)简称ppc。二聚体中、因两个单体的构象或键合位置的不同、可有多种异构体、已分离鉴定的8种结构形式分别命名为b1-b8，其中、blb4是由4-8位c-c键合、b5b8由4-6位c-c键合。在各类原花青素中，二聚体分布最广，研究最多、是最重要的一类原花青素。三聚体中，也因组成的单体及其相连接碳原子位置的不同形成各种各样的结构并命名为c1、c2等，其中c1在自然界中分布最丰富。葡萄籽提取物原花青素呈棕色粉末溶于水、乙醇、甲醇、丙酮，也可溶于乙酸乙酯，不溶于乙醚、氯仿、苯等。有涩味。在280nn处有强的紫外吸收。高品质的低聚原花青素在水和醇中有良好的溶解性，色泽亮丽。原花青素最具特征性的化学反应是在酸性溶液中加热可降解和氧化形成花色素(batesmith反应)。原花青素在酸性溶液中同时发生自身缩合现象。一般情况下，在水溶液中缩合反应的趋势更明显，在醇溶液中，以花色素反应为主。目前对葡萄opc的研究一直处于领先地位共分离鉴定出16种pc，其中有8种二聚体、4种三聚体的opc。原花青素是一种很强的天然抗氧化剂和ve再生剂，能显著抑制肝、脑中tpa诱导的脂质过氧化和dna分裂，效果明显优于ve、vc和-胡萝卜素。随着pc研究的不断深入，发现opc具有强大的抗氧化性和广阔的药理活性。经文献研究表明，低聚原花青素具有100%的生物利用率，是最强大的抗氧化剂。而现代药理学研究表明：低聚原花青素可保护心血管系统、改善微循环、抗肿瘤、抗突变、抗衰老、抗菌抗病毒、抗溃疡、改善视力、改善脑功能等与80多种疾病有关。经过40多年广泛临床、毒理学、药物动力学研究证明，其无毒、非致癌、非致畸，并以安全、高效、高生物利用度著称已有20年。因此，使其在医药、保健食品和化妆品领域得到广泛应用，引起各领域越来越多学者的关注。葡萄籽中已分离鉴定的低聚原花青素如图。procyanidin(48) dimersr1=h,r2=oh (+)-caiechinr1=oh,r2=h (-)-epicaiechinprocyanidin(46) dimers葡萄籽中主要代表物原花青素的化学结构（n表示以上的整数）低聚原花青素结构1 原花青素的生化活性研究进展自二十世纪80年代以来，人们对数十种植物的原花青素低聚体和高聚体进行了生化、药理活性的研究。不同聚合度的原花青素其生化、药理活性不尽相同。其中对葡萄籽原花青素低聚体的研究独占熬头，取得了突破性进展。法国masquelier j在对原花青素皮肤学方面研究发现，原花青素对皮肤保护和治疗作用与其清除自由基的能力密切相关，而环境对皮肤、粘膜和毛发的刺激引起的脂质、蛋白质与核酸的衰退过程均与自由基分不开。原花青素的多羟基结构赋予其特殊的抗氧化活性和清除自由基能力，为其在保护皮肤的化妆品领域应用提供了可靠的基础。1.1抗氧化活性原花青素清除自由基和抗氧化活性的显著作用已得到国内外学者和人们的肯定。原花青素对各种疾病的治疗作用也与其超强的清除自由基能力和抗氧化活性密切有关。1951年，法国masqudier j从松树皮中提取到原花青素，随后发现原花青素具有清除自由基和抗氧化活性，又证明葡萄籽中低聚原花青素的抗氧化活性是ve的50倍，vc的20倍，是一种很好的氧自由基清除剂和脂质过氧化抑制剂。至此，关于原花青素清除各类自由基和抗氧化作用相继报道。noda等，通过esr分析技术对天然植物、健康食品和抗氧化物质进行o2、oh清除活性实验，结果发现原花青素捕获oh能力强于银杏提取物，在抗氧化方面则强于-儿茶素和茶叶提取物。葡萄籽原花青素能有效地清除o2、oh、h2o2、onoo-和全血嗜中性白细胞“呼吸爆发”产生的多种活性氧而抑制体系发光，并有效抑制脂质过氧化，保护dna免受oh引起的氧化损伤。 原花青素的聚合度对其抗氧化活性也有很大影响。原花青素二聚体的抗氧化活性最强。原花青素抑制低密度脂蛋白氧化活性与其结构和聚合度密切相关。plumb等对儿茶素和原花青素抗氧化活性研究发现，原花青素抗氧化活性在油相中随聚合度而降低；在水相中抗氧化活性从单体到三聚体是增加的，而三聚体到五聚体的抗氧化活性则逐渐下降，儿茶素与原花青素二聚体棓酰化产物抗氧化活性在油相中减弱，而在水相中增强；对儿茶素糖基化实验证明其产物在油、水两相中抗氧化活性均下降。bagchi d等在对醋酸酚（tpa）诱导的小鼠大脑和肝脏脂质过氧化和dna 损伤研究中，指出了葡萄籽原花青素对小鼠大脑和肝脏脂质过氧化和dna 损伤都有较强的抑制作用，并与原花青素存在剂量依赖关系。在以谷氨酸盐诱导的神经胶质细胞毒模型中，原花青素通过抗氧化作用可保护神经细胞免受谷氨酸盐的损害。原花青素不仅对巴豆油刺激多形核白细胞（pmns）生成h2o2有显著的抑制作用，而且还可抑制h2o2释放；并能抗巴豆油诱发的小鼠肝线粒体脂质过氧化，提高肝线粒体sod活力，减少mda生成。原花青素对h2o2诱导的大鼠fao肝癌细胞氧化有较好的抑制作用，能降低mda和ldh含量，显著增加还原型/氧化型谷胱甘肽的比例，维持过氧化氢酶水平，使谷胱甘肽过氧化物酶活性增强，并提高谷胱甘肽还原酶和谷胱甘肽转移酶活性。葡萄和葡萄籽提取物原花青素对cu2+/aaph或sin-1和单核巨噬细胞过氧化物释放而诱导的ldl氧化有较好的保护作用。给小鼠每天连续灌胃200、400mg/kg.bw的野生山葡萄多酚（主要成分为原花青素）30d，可显著降低小鼠心、肝、肾、脑组织中mda及脂褐质的含量（p0.05），当每天给予400mg/kg.bw时可极显著提高心、脑组织sod活性，降低心、脑组织脂褐质及mda含量（p0.01）。给糖尿病大鼠腹腔每天注射10mg/kg.bw自法国松树皮提取的原花青素14d，能提高链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠抗氧化能力，使肝、心、肾中过氧化氢酶恢复到正常水平，并能提高谷胱甘肽还原酶水平。人体每天食用0.375g/kg.bw可可粉（含儿茶素、表儿茶素和原花青素 b-2）对aaph诱导的人红细胞氧化溶血有较好的保护作用，并达到显著性差异（p0.05）。maffei f r等研究高相对分子质量儿茶素寡聚体在0.11.0mmol/l时能防止细胞膜中ve损失，显著减少膜脂质过氧化，明显推迟细胞溶血的发生时间。在oh诱导的卵磷脂过氧化作用中，葡萄籽原花青素具有显著地剂量依赖性保护ve的消耗，并证实葡萄籽原花青素可使ve再生。健康人每天食用原花青素110mg，连续30d，可以使红细胞膜中ve的水平从(1.80.1)mg/g增加到(2.80.2) mg/g，同样使淋巴细胞dna氧化水平从7.232.47降低到2.340.51，并能提高红细胞膜不饱和脂肪酸含量。说明原花青素在体内可以保护红细胞膜中的ve和减少dna氧化损伤。1.2抗衰老作用当植物成熟时，它们产生了叫做花青素的植物化学物质。这些植物化学物质保护植物免受阳光引发的自由基伤害。许多物质和某些环境（如阳光曝晒）会在人体内产生自由基，这些植物化学物质也保护我们身体免受这些自由基伤害。今天，科学家认为，起因于自由基对细胞的伤害，是引发大量疾病的首要因素，这些疾病包括癌症、心血管问题、关节炎、糖尿病、中风、白内障等。另外，花青素还保护大脑与神经组织，因为它有跨越血脑屏障的独特能力；它能改善血液循环，减少炎症；它与胶原蛋白结合，助长细胞完善，使你有灵活的关节和年青人那样的皮肤。可见，花青素这种奇妙物质多方面有益于人体健康，可能正好是我们寻找的“青春之源”。原花青素抗衰老研究较早。masqudier j和美国专利均有报道，低聚原花青素的分子配置对胶原质的稳定性最适合，对胶原纤维的弹性恢复、交联及稳定效果最好。并通过体外实验测定弹性蛋白酶（猪胰弹性蛋白酶和人白细胞弹性蛋白酶）的降低来评价原花青素对胶原蛋白保护作用。结果，原花青素组对猪胰弹性蛋白酶的抑制率达到86.6%，对人白细胞弹性蛋白酶的抑制率高达100%。而儿茶素对猪胰弹性蛋白酶抑制率仅为27.8%，对人白细胞弹性蛋白酶无抑制作用。体内研究结果表明，当将原花青素注入幼兔皮肤内时，可束缚皮内弹性纤维。将其相同量注入猪的皮内，同样抑制胰蛋白酶水解弹性蛋白，使皮内周围的弹性蛋白大量重建。同时证明，在炎症过程中，原花青素可潜在抑制弹性蛋白酶对弹性蛋白的降解作用。原花青素对vc保护和再生的同时，对维持胶原质的弹性和强度也起作用。相关报道同样证明原花青素可改善皮肤皱纹和调节皮肤功能。deters a等在探讨金缕梅皮原花青素对培养的人皮肤角质细胞增殖和分化的影响研究中，得到金缕梅皮原花青素能明显促进角质细胞增殖，且无分化作用，促进皮肤角质细胞新陈代谢，延缓皮肤衰老。在sls刺激皮肤的实验中，原花青素可以减少透皮水分损耗和红斑的形成。此外，临床研究表明原花青素能有效的改变刺激过程。另一方面，原花青素的抗氧化作用也是其抗衰老作用的基础。原花青素具有良好的抗氧化功能，使其一定程度上延缓d-半乳糖所致小鼠衰老，使衰老模型小鼠血清、肝、脑组织中lpo水平均有不同程度的下降。血、肝中sod活性水平有不同程度的上升。脑脂褐质水平下降。同样给老龄大鼠每天连续灌胃200mg/kg.bw和400mg/kg.bw原花青素30d，结果200mg/kg.bw剂量组显著降低老龄大鼠血清中mda和脑组织脂褐素含量(p0.05)，400mg/kg.bw剂量组提高老龄大鼠血清sod活性(p0.05)。原花青素也会降低正常小鼠血中mda和升高血清sod活力，延长果蝇平均寿命。1.3美白作用欧洲人称花青素为青春营养品，皮肤维生素，口服化妆品。因为它能恢复胶原蛋白活力，使皮肤平滑而有弹性。胶原蛋白是皮肤的基本成份，并且是一种使我们身体成为一个整体的胶状物质。维生素c是生化合成胶原蛋白必要的营养品。花青素使更多的维生素c生效，这意味着，维生素c可以更容易地去完成它所有功能（包括胶原蛋白产生）。花青素连接在胶原蛋白上，可以阻止那些破坏胶原蛋白的酶的危害。花青素不仅帮助胶原蛋白纤维形成交联结构，而且可以帮助恢复因受伤和自由基所引起的过度交联的损害。过度交联会使结缔组织窒息和硬化，从而使皮肤起皱纹和过早老化。花青素还保护人体免受阳光伤害，促进治愈牛皮癣和寿斑。花青素也是局部施用的皮肤霜的极好添加剂。皮肤黑化、雀斑、褐斑和老年斑的出现，都与体内酪氨酸酶活性增高密切相关。此酶在皮肤组织的黑色素细胞代谢中起催化作用，引起黑色素分泌的增加。因此降低酪氨酸酶的活性，从而减少色素细胞的代谢强度，以减少色素的生成。另一方面，在黑色素颗粒的成长中，即由体内的酪氨酸在酪氨酸酶催化下转化为多巴、多巴醌、多巴色素、吲哚、吲哚醌，最终转变为聚合体的色素颗粒，一直是一个氧化过程，活性氧在其中表现出重要的作用。因原花青素作为氧自由基清除剂和抗氧化剂可清除活性氧和还原黑色素中间体，抑制黑色素的生成。日本学者keiji takagi和tohrmitsunaga研究从木本植物karamatsu皮 ( larix sp.)， 阿拉伯树胶 ( acacia mearnsii) 和 民间白坚木( schinopsis lorentzii)中提取的原花青素对酪氨酸酶有较强的抑制作用，并证明其抑制作用与原花青素a环5，7-二羟基结构和b环3，4，5-三羟基结构有关。日本yamaskosh研制了含有1%原花青素低聚体的可使皮肤亮洁的油性化妆品，它是基于原花青素可抑制酪氨酸酶的活性而研制成功。其机理尚不清楚，可能是与原花青素具有金属络合特性有关。茶单宁和葡萄单宁在100mg/ml浓度下即可完全抑制因蛋白质氨基和核酸氨基发生的美拉德反应，从而抑制了脂褐素、老年斑的形成，起到美白的作用。1.4 收敛和保湿作用原花青素的收敛作用，可使粗大的毛孔收缩，汗腺膨胀，使松弛的皮肤收敛、绷紧、减少皱纹，从而让皮肤显现出细腻的外观。日本学者小岛弘之等报道，利用单宁酸（含原花青素）对油性发质表现出良好的作用，其接触皮肤后，可使汗腺口肿胀而堵塞汗液的渗透，抑制排汗，从而达到减少汗液分泌量。因此开发出含单宁的抑汗剂，调整型收敛液。原花青素的保湿作用基于原花青素具有多羟基结构。在空气中易吸湿是因为原花青素能与多糖（透明质酸）、蛋白质、脂类（磷脂）、多肽等复合的特性。利用原花青素此特性，开发出含有葡萄籽原花青素（0.01 v /v）奶液。日本开发出含有4%肉桂单宁的提高皮肤湿度的化妆品，是基于原花青素的分子中含有亲水性的酚羟基结构这一特性。1.5免疫调节作用花青素不仅帮助减缓心血管发炎，且也帮助治疗许多疾病，例如，过敏、气喘、支气管炎、花粉热、类风湿动脉炎、运动受伤、压力溃疡等。人体发炎时要释放出一种名叫组胺的化合物，它可诱发上述疾病的种种症状。花青素抑制产生组胺需要的酶，防止生成组胺，从而减轻发炎。花青素是组胺的著名的抑制剂，但它并不阻碍其它的酶。现在，我们身体过多地承受了来自食品、饮用水、空气和动植物（如花粉）的化学物质及污染物，其结果，过敏便成了非常普遍的疾病。有关花青素抗过敏和抗炎症的能力，许多文献都有记载。运动员很赏识花青素，因为花青素使关节灵活、可以修复结缔组织内的胶原蛋白，以及减轻水肿。还有报道，花青素改善许多人的关节炎症。原花青素对机体免疫功能调节作用也可以间接的对皮肤产生保护作用。liu等报道原花青素对老化小鼠(sam)免疫和造血功能不全有调节作用。使sam的t、b淋巴细胞功能均明显提高，骨髓造血干细胞的增殖活性得到增强。原花青素对因甲醇或感染鼠逆转录病毒引起的小鼠免疫功能不全具有动态调节作用，能促进小鼠体内il-2的产生，减少感染逆转录病毒的小鼠细胞所产生il-6的数量，降低食用甲醇小鼠脾细胞所产生il-10的水平，同时还可增加自然杀伤细胞的细胞毒性。gerardo g m等探讨儿茶素、表儿茶素和原花青素二聚体b，对pma刺激t细胞nf-b活性的影响。将t细胞预先用儿茶素、表儿茶素和原花青素二聚体b处理，则可以减弱pma引起nf-b黏附活性增强和降低nf-b激活的il-2基因。表明，儿茶素、表儿茶素和原花青素二聚体b能通过调节t细胞内nf-b 来调节免疫应答。原花青素单体到十聚体对植物凝集素（pha）刺激外周血单核细胞（pbmc）的转录水平和蛋白分泌均有不同程度影响。原花青素从五聚体到十聚体随着聚合度的增加能显著刺激il-1浓度增加（增加9倍），也使il-4浓度增加。另外，高聚合度的原花青素对pha诱导的基因表达也有影响，与pha对照组相比原花青素五到十聚体能使il-1表达增加7%19%，六到十聚体能抑制pha诱导的il-4的转录，抑制率达71%86%。同时观察pha刺激的单核细胞转录水平即il-1反应的蛋白水平及有丝分裂原刺激il-4产生的蛋白水平，结果，低聚体对单核细胞中il-2转录水平没有影响，而五聚体、六聚体和七聚体，能有效抑制il-2基因表达，抑制率达61%73%。mao t k等探讨原花青素单体到十聚体对13名健康人外周血单核细胞转移生长因子(tgf)-1的分泌调节作用。结果，原花青素单体和二聚体对外周血tgf-1低水平者能显著性提高tgf-1水平，且单体和二聚体最佳，分别增加66%和68%；而三聚体到十聚体对外周血tgf-1高水平者能显著性降低tgf-1水平，其抑制率达28%42%。葡萄籽原花青素能激活正常人外周血th1细胞产生 ifn-（-干扰素），由rt-pcr证明原花青素能有效促进ifn-mrna的转录 ，得到原花青素能促进ifn-的合成和分泌来增强免疫功能。1.6 原花青素对皮肤保护作用研究展望清除自由基和抗氧化作用是原花青素生物活性中研究最早和较为深入的一部分。原花青素能有效清除羟基自由基、超氧阴离子自由基、一氧化氮、过氧化氢等活性氧和活性氮，对各种原因引起的生物大分子损伤和脂质过氧化均有抑制作用，并能调节或提高机体的抗氧化酶活性，降低脂质过氧化产物的生成。这些作用都间接增强其对皮肤的保护作用。皮肤作为人体最大器官也有其固有的抗氧化酶系统，这种酶系统的平衡对于维持皮肤正常功能及延缓皮肤衰老具有重要的意义。而原花青素对皮肤的保护作用中缺少对正常皮肤或损伤皮肤内抗氧化酶系统的调节作用研究，通过这方面的研究能直接表现出原花青素对正常皮肤和损伤皮肤是否有保护和恢复作用。随着原花青素的深入研究和开发，用于原花青素生产的资源较单一，40多年来主要利用的资源是葡萄籽和皮。为了改变这种状况，必须寻找可利用的新资源。本项目是在前人研究发现莲，特别是其非可食部分莲房中含有与人体健康和生命密切相关的重要天然活性物质原花青素，含量高于目前国内外研究和利用最多的葡萄籽和皮，有望成为原花青素利用的新资源的基础上开展的！2 原花青素的应用2.1 在药物方面的应用在法国，用葡萄籽原花青素制成的专利产品用于治疗微循环疾病，包括眼睛与外周毛细血管通透性疾病及静脉与淋巴功能不全。法国sanofi公司用葡萄籽原花青素与大豆卵磷脂制成复合物，用作血管保护剂和抗炎剂，每年含复合物250mg。法国的vennat等还制成了含80%原花青素的高剂量片(50mg片)，改进了处方，使此片剂能迅速而完全释放，而且在不同条件下，贮存10个月仍有很好稳定性。此外，德国的brekhman等研制了用于治疗酒精中毒的原花青素制剂并获专利保护。在罗马尼亚，一种商品名为endotelon的原花青素制剂已上市用于治疗毛细血管疾病。2.1.1.心脏保护剂花青素不仅帮助恢复皮肤弹性，而且也帮助关节、动脉以及其它组织（如心脏）维持正常功能。血管系统负责血液流动，把血液送到所有细胞和组织。因此，不管是从长期和短期效果来看，花青素都是至今发现的、最好的心脏保护剂。花青素也抑制组胺产生，因而可减轻炎症，帮助动脉抗拒那些引发心血管病的诱变因素的冲击。尽管法国人通常吃高脂肪食物远多于美国人，但法国人死于心脏病的比例比美国人少很多，法国人以爱喝酒出名，通常是进餐必饮。法国饮君子患冠心病的人数也比不沾酒的人群低30%到40%，这是因为法国红葡萄酒中含有花青素。2.1.2.视力保护者糖尿病性视网膜病是糖尿病的征兆，它是眼睛毛细血管微出血引起的，是成年盲人的常见病因。法国允许用花青素治疗该病已经很多年了。这一方法显著减少了眼睛毛细血管出血，改善了视力。花青素也已经用来防止糖尿病患者白内障手术后的并发症。1998年，专家们选择了许多没有眼病眼伤的人做试验，考察花青素是否可以缓解夜盲症。参加者分成两组，一组是晚上开车的司机，一组是整天和电脑屏幕为伴的人。四个星期后，再检查他们的耐盲能力，98%的试验者有了改善。2.1.3 血液循环在欧洲，为了改善血液循环、治疗糖尿病性视网膜病、减轻水肿和抑制静脉曲张等，花青素己用于临床治疗几十年。花青素可以强化毛细血管、动脉与静脉血管，因此，它有消肿化淤的功效。毛细血管的阻力减少和渗透性改善，使细胞更容易吸收养分与排除废物。输送养分与运出废物这是血液循环系统的功能。心脏负责抽压血液；动脉与静脉血管输送血液；而负责运送营养给细胞，又运出废物的是毛细血管。花青素可以清除细胞膜中水溶性和脂溶性的自由基，因此，抑制了释放某些酶去伤害毛细血管壁的过程。2.1.4 维生素c的增效剂维生素c又叫抗坏血酸，维生素c和它的辅助因子是产生细胞内部材料必需的成份，这些材料支持结缔组织，形成像胶结剂那样的物质，用于修理骨骼、毛细血管、软骨和牙质。缺乏维生素c会造成身体虚弱、不易治愈的折伤、结缔组织不坚固、血管壁脆弱与多孔，最后能引起毛细血管破裂和出血。假如人体缺少维生素c长达三个月，就会患所谓的坏血病。坏血病患者有如下病症：体质虚弱、牙床软化而出血、掉牙、皮肤生疮、关节肿痛、皮下出血等。研究表明，缺少维生素c的人是很普遍的。许多人都有早期坏血病的诊兆。长期缺少维生素c，人体会受到严重摧残。现在人们懂得了，仅仅补充抗坏血酸，不是纠正维生素c缺乏症的答案。人们还需要补充花青素，使维生素c发挥最大效益。大多数动物能自身产生维生素c，但是，人类一定要依靠食物才能获得确保健康所需的维生素c。对于长期漂泊海上而缺少新鲜水果和蔬菜的水手们来说，坏血病曾经是一种令人恐惧的流行病。早在十九世纪初期，英国水手就发现，吃柠檬可防止坏血病。在masquelier发现花青素之前，动物实验表明：天然来源的抗坏血酸防止坏血病的能力比较高，而纯化了的或合成的抗坏血酸活性比较低。这吸引了许多科学家和医生去寻找维生素c的辅助因子。他还指出，聪明人每次服用花青素的时候，也要服用维生素c，因为花青素是维生素c的增效剂。2.2 在食品方面的应用原花青素作为天然强力自由基清除剂倍受青睐，国外，已广泛用于延缓衰老、调节血压血脂、抗肿瘤、健脑等保健食品中。原花青素作为具有极强抗氧化性的天然功能性成分，在欧美被广泛加入到各种普通食品如蛋糕、奶酪中，既作为营养强化剂，又作为天然防腐剂来替代合成防腐剂(如苯甲酸等)，符合人们回归自然的要求，提高了食品的安全性。2.3 在化妆品领域的应用原花青素的多羟基结构使它具有特殊抗氧活性和清除自由基的能力，已成为科学家关注的热点，也为其在化妆品领域开辟了广阔前景。原花青素具有独特的化学和生理活性，在护肤品中起到多重作用，如抗衰老、抗紫外线、抗辐射、增白、保湿等，对多种因素造成的皮肤老化都有独特的功效。低聚原花青可减少皱纹，增加皮肤弹性。一方面，它可促进胶原蛋白形成适度的交联，维护胶原的生合成；另一方面，它作为一种有效的自由基清除剂，可预防“过度交联”这种反常生理状况的发生，从而阻止了皮肤皱纹和囊泡的出现，保持皮肤的柔顺光滑。opc清除自由基，阻断硬弹性蛋白酶的产生并抑制其活性，因而根本上改善皮肤的健康状况。改善皮肤的健康循环。从而避免或减少皱纹的产生。原花青素经过多年的开发研究和临床应用，以其优越的抗氧化活性为人们所青睐。其既可作为营养强化剂，又可作为防腐剂替代合成防腐剂(如苯甲酸等)，符合人们回归自然的要求.提高了其应用的安全性。因此.我们应充分利用我国植物资源，如葡萄、甘薯、山植、花生、银杏、大黄、莲房等，结合我国传统中医药技术，开发出适宜而又有功效的原花青素产品，使这一资源的开发和利用提高到一个新的阶段。3 实验的目的和意义 鉴于以上文献综述，关于原花青素具有多种生物活性，其中，抗氧化研究已有不少报道，故本论文以分离得到的莲房，莲子壳中活性因子原花青素（多酚）为试验材料，以vc为对照做比较，通过还原力测定、抗氧化值测定、对羟基自由基的抑制作用、对超氧阴离子自由基的清除作用等一系列的试验，初步探讨lspc抗氧化作用机制，并与vc做对比。旨在为提高莲房、莲子壳中原花青素的提取率，为提高莲房，莲子壳的利用率和应用价值，包括在药理方面、营养方面和人类生命方面等的产品的开发提供参考，为莲资源开发应用开辟新途径。也为一些前沿科学研究提供一些理论基础。4. 课题主要研究内容根据本文的研究目的，将从以下四部分研究。第一部分 前言、目的和意义第二部分 微波辅助提取原花青素的工艺第三部分 莲房（及莲子壳）原花青素的抗氧化能力的研究第四部分 结论第 二 章 微波辅助提取原花青素的工艺引言直接使用试剂浸泡原材料来提取莲中的原花青素的得率不高，且所需的时间比较长，所以在工业化中用这种方法提取原花青素的经济价值不高。因此迫切需要改进提取原花青素的方法，经过科研工作者的不断努力、实验，终于探究出了利用改变外界条件的方法来辅助提取原花青素的方法。经过实验发现，通过微波辅助、超声波辅助以及改变提取温度等方法可以提高原花青素的得率。本实验就是通过微波辅助的方法来提取原花青素，通过控制改变微波的输出功率、微波作用时间，原材料与试剂的料液比及萃取次数等条件来探究微波富足后提取的具体效果，旨在找出一个最佳的工艺条件，并利用原花青素的初提液进行抗氧化试验，以此来探究原花青素的抗氧化能力、清除自由基的能力，通过证明其具有抗氧化能力来说明原花青素在抗衰老、护肤等方面是有功效的。因此为药理学、生命科学研究等方面提供一点理论基础和科学依据。1 材料与方法1.1 试剂与仪器1.1.1 试剂没食子酸生物试剂中国药品生物检定所儿茶素生物试剂中国药品生物检定所乙醇分析纯江苏省宜兴市兴洋企业浓盐酸分析纯温州天盛电化有限公司香草醛分析纯青岛裕达精细化工有限公司甲醇分析纯江苏省宜兴市兴洋企业nahco3分析纯上海四星医药科技工贸公司folin-clocalteau 分析纯sigma公司儿茶素，没食子酸分析纯sigma公司莲房，莲子壳，分析纯sigma公司1.1.2 器材与仪器722分光光度计上海精密科学仪器有限公司微波炉lg电子（天津）电器有限公司恒温烘箱101a3s 上海意丰电炉有限公司电子天平上海精密科学仪器有限公司大小烧杯、锥形瓶若干、不同规格的离心管、滴管、移液管、玻璃棒、移液枪等。1.2实验方法莲房的预处理：将莲房筛选除去杂质后粉碎过60目筛，用正己烷脱脂后待用。1.2.1 总酚含量的测定folin-clocalteau法。配制试剂：稀释十倍的folin-clocalteau原液试剂及15%的碳酸钠溶液。标准曲线的绘制：精确称取没食子酸1.0mg用水溶解并定容到10ml得0.1mg/ml的对照品标准溶液，精确吸取对照样品溶液0.20ml、0.25ml、0.30ml、0.35ml、0.40ml、0.50ml、0.60ml于10ml容量瓶中，再加入1ml folin-clocalteau试剂，摇匀后再加入2ml 15%碳酸钠溶液，定容到10ml，室温下反应2小时后测定a760，绘制标准曲线。提取液中总多酚含量的测定：移取待测提取液0.5ml于10ml容量瓶中，依次假如1.0ml folin-clocalteau（稀释后）显色剂及2ml 15%碳酸钠溶液并定容，反应2h后测定（a760）吸光度值,根据标准曲线计算多酚的没食子酸当量，并计算提取得率。1.2.2 原花青素含量的测定香草醛-浓盐酸法.配制试剂：40.0g/l的香草醛-甲醇溶液。精确称取2.0g香草醛（香兰素）固体溶解到50ml甲醇中，混匀待用。标准曲线的绘制：精密称取儿茶素（对照品）5.0mg用去离子水定容到25.0ml，得1.0mg/ml的儿茶素标准溶液。用移液管移取儿茶素标准溶液1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml、3.5ml、4.0ml,用去离子水定容到10ml得不同浓度的对比溶液。依次移取1.0ml的对比溶液到对应的容量瓶中，再依次加入3.0ml香草醛-甲醇，1.5ml浓盐酸，混合均匀后在水浴锅中20反应15分钟。以3.0ml香草醛-甲醇、1.5ml浓盐酸、0.5ml甲醇的混合液作为空白对照，在500nm处测吸光度值，得到标准曲线的回归方程。1.2.3单因素实验1.2.3.1 溶剂选择精密称取4份1.00g的莲房粉放入100ml的烧杯中，微波功率一定，料液比一定，微波作用一定时间，以提取绿为衡量标准，考察不同溶剂70%的丙酮、70%的乙醇、70%的甲醇和水（加入亚硫酸氢钠1%）对总多酚和原花青素提取效果的影响，确定一种作为后续溶剂。1.2.3.2 溶剂浓度的选择精密称取7份1.00g的莲房粉放入锥形瓶中，加入一定浓度，一定料液比的溶剂，微波功率一定，萃取时间一定，考察不同浓度溶剂（20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、）对提取效果的影响然后进行多酚和原花青素提取绿的影响。1.2.3.3 微波作用时间的影响精密称取7份1.00g的莲房粉放入锥形瓶中，以选定溶剂为提取剂，微波功率一定(80%输出功率)，料液比一定，微波作用一定时间后一提取绿为衡量指标，考察了微波作用时间（30s、40s、50s、60s、70s、80s、90s、100s）对总酚和原花青素提取效果的影响。1.2.3.4 微波萃取功率的影响精密称取5份1.00g的莲房粉放入100ml的烧杯中，以选定溶剂为提取剂，一定料液比，微波作用50s后，以提取绿为衡量指标，考察了微波功率（20%、40%、60%、80%、100%）对总酚和原花青素提取效果的影响。1.2.3.5 料液比的影响 精密称取5份1.00g的莲房粉放入锥形瓶中，以选定溶剂为提取剂，微波功率为中火（80%功率）微波作用时间90s后，以提取率为衡量指标考察了料液比（1：10、1：15、1：20、1：25、1：30、1：35（m/v）对总酚和原花青素提取效果的影响。 1.2.3.6 萃取次数的影响 精密称取4份1.00g的莲房粉放入锥形瓶中，以选定溶剂为提取剂，料液比为一定，微波功率为中火（80%功率），微波处理90s,以提取率为指标，考察了提取次数（1、2、3、4次）对总酚和原花青素提取效果的影响。1.2.3.7 ph值对萃取得率的影响 精密称取6份1.00g的莲房粉，置于250ml三角瓶中，加入适量的选定溶剂，用5mol/l盐酸来调节ph分别为2、3、4、5、6、7，于室温下浸提，以提取率为衡量指标，对总酚和原花青素提取效果的影响。1.2.3.8 正交实验精确称取莲房粉9份，每份1 g，置于三角瓶中，按l9(34)正交表设计实验浸提条件，提取过滤、离心合并滤液，于真空条件下浓缩回收酒精，浓缩样品，定容，测定莲房多酚和原花青素的含量。水平因素溶剂容度a萃取功率b萃取时间c料液比d1111122222333332结果与分析2.1标准曲线：图-1 总酚标准曲线fig-1 total phenol standard curvey（总酚）=0.1997x+0.0012 r2 = 0.9973图-2 原花青素含量标准曲线fig-2 proanthocyanidins content standard curvey（ 原花青素）= 0.0996x + 0.0009 r2 = 0.9959r值都在0.99以上，满足线性回归。得回归方程为y=ax+b(其中y为没食子酸的含量mg，x为吸光度值)2.2单因素实验2.2.1 溶剂选择 图-3 溶剂选择fig-3 solvent choice如（图-3）所示，在所有实验中，用丙酮作为萃取剂的组不论是原花青素得率还是总酚得率，其数值都高于其他溶剂，因此与之相比丙酮是比较理想的萃取剂。2.2.2 溶剂浓度选择 图-4 溶剂浓度选择fig-4 solvent concentration choice如（图-4）所示，用不同浓度的丙酮作为萃取剂，原花青素和总酚的得率都是在丙酮浓度在60%是达到最大值。2.2.3 微波作用时间的影响图-5 微波作用时间的影响fig-5 microwave time of impact在其它条件相同的情况下，考虑微波作用时间的不同对原花青素和总酚得率的影响，如（图-5）所示，当微波作用时间定为90s时，其得率是最高的。2.2.4 微波萃取功率的影响图-6 微波萃取功率的影响fig-6 microwave power extraction of impact 在其它条件不变的情况下考虑通过改变微波的输出功率对原花青素和总酚的得率的影响。如（图-6）所示，当把微波的输出功率调整到80%（即560w）时，原花青素和总酚的得率达到最高值。2.2.5 料液比的影响图-7 料液比的影响fig-7 feed ratio of impact 在微波输出功率，微波作用时间都一定时，通过调整料液比来观察其对原花青素和总酚得率的影响。如（图-7）所示当料液比为1：25时，两者的得率都在同条件下达到最高。2.2.6 萃取次数的影响图-8 萃取次数的影响fig-8 extraction number of impact 如（图-8）所示，当萃取次数达到3次以后，原花青素和总酚的得率都趋于平行，表明再做多余的萃取次数已经没有必要了。2.2.7 ph值的影响图-9 ph值的影响fig-9 ph value of impact通过调整溶剂的ph值来观察其对两者的得率的影响，如（图-9）所示ph值对总酚的影响不大，而且当ph值调整为5时，两者的得率都是最高的。2.2.8正交实验通过以上单因素实验，以溶剂浓度、微波输出功率、微波作用时间和料液比为四个考察因素，做四因素三水平（l9(34)）的正交实验，如（表-1）、（表-2）表-1 原花青素正交实验表tabie-1 proanthocyanidins orthogonal table试管号因素原花青素得率丙酮浓度微波功率微波作用时间料液比（%）111113.242 212224.229 313335.552 421233.659 522314.891 623124.658 731324.680 832134.963 933213.034 k113.023 11.581 12.863 11.167 k213.208 14.083 10.922 13.568 4.323 k312.677 13.245 15.123 14.173 k14.341 3.860 4.288 3.722 k24.403 4.694 3.641 4.523 k34.226 4.415 5.041 4.724 表-2 总酚正交实验表table-2 total phenol orthogonal table试管号因素总酚得率丙酮浓度微波功率微波作用时间料液 比（mg/g)111117.616 2122210.438 3133312.568 4212312.484 522317.862 623129.602 7313210.317 8321312.497 933217.268 k130.621 30.417 29.714 22.746 k229.948 30.797 30.190 30.357 10.072 k330.081 29.437 30.747 37.548 k110.207 10.139 9.905 7.582 k29.983 10.266 10.063 10.119 k310.027 9.812 10.249 12.516 2.2.9 重复实验图-10 重复实验fig-10 repeat experiments经过正交试验确定最佳的微波辅助提取原花青素的条件是，控制微波作用时间为90s，微波的输出功率为80%（即560w），并且配制丙酮浓度为60%，料液比为1：25（1g:25ml），通过重复实验验证，利用最佳的实验条件进行的实验的原花青素和总酚的得率是所有单因素实验中最高的。2.3 水提原花青素的单因素实验2.3.1 微波作用时间的影响图-11 微波作用时间的影响fig-11 microwave time of impact在对单因素-时间进行试验时，如图-11所示，微波作用时间定为90s时原花青素和总酚的得率都达到其它条件相同下的最高值。2.3.2 微波萃取功率的影响 图-12 微波输出功率的影响fig-12 microwave power extraction of impact 如图-12所示，当微波输出功率为80%（即560w）时，原花青素和总酚的得率在同条件下达到最高。2.3.3 料液比的影响 图-13 料液比的影响fig-13 feed ratio of impact如图-17所示，当料液比为1：25时，原花青素的得率达到最高值。而当料液比为1：30时总酚的得率达到最高值。2.3.4 萃取次数的影响 图-14 萃取次数的影响fig-14 extraction number of impact 如图-14所示当萃取次数达到3次之后，原花青素和总酚的得率已经相当低了，所以经过3次萃取后就没有必要在进行萃取了。2.3.5 正交试验表-3 水提原花青素正交试验表table-3 proanthocyanidins orthogonal table试管号因素原花青素得率微波功率微波时间料液比（mg/g)11115.002 21227.083 31337.733 42127.737 52237.478 62316.814 73138.167 83216.595 93328.446 k119.818 20.906 18.410 k222.029 21.156 23.267 7.228 k323.208 22.993 23.377 k16.606 6.969 6.137 k27.343 7.052 7.756 k37.736 7.664 7.792 运用表-1、表-2的方法，以微波输出功率、微波作用时间和料液比三个因素作为考察因素作三因素三水平正交表，如表-3。2.4紫外扫描 为了观察用丙酮作为萃取剂来萃取原花青素和总酚在得到原花青素初提液时是否同时破坏了原花青素的结构，因此将丙酮-莲房、丙酮-敛资壳的初提液通过旋转蒸发，再用60%的丙酮溶解，在196nm900nm范围内做全波长紫外扫描，并与标准品进行对比。如（图913） 图-15丙酮-莲房紫外扫描fig-15 acetone-lian the uv scanning图-16 丙酮-莲子壳紫外扫描fig-16 acetone-seed shells uv scanning 图-17 丙酮-葡萄标准品紫外扫描fig-17 acetone-grape standard uv scanning 图-18 微波-莲房紫外扫描fig-18 microwave-lian the uv scanning图-19 微波-莲子壳紫外扫描fig-19 microwave-seed shells uv scanning 通过对图-1519的比较，发现其吸收峰的位子基本上相同，这说明微波并没有破坏原花青素的结构，虽然在280nm处没有明显的吸收峰，但这可能是丙酮将其它的杂质也带了出来。图-20 亚硫酸氢钠-莲房紫外扫描fig-20 sodium bisulfite-the uv scanning lotus图-21 亚硫酸氢钠-莲子壳紫外扫描fig-21 sodium bisulfite- seed shells uv-shell 用1%亚硫酸氢钠溶液提取原花青素的初提液在196nm900nm范围内作全波长紫外扫描如图-20、21，可以看出再280nm附近有吸收峰，这与一些相关报道是相符合的。3.讨论通过作原花青素的标准曲线，进行一系列单因素试验，以及通过正交实验进行选择最佳的实验条件，并用重复试验来验证通过正交实验选出的最佳方案的稳定性和可靠性。通过以上试验可以证明利用微波辅助提取原花青素是可取的，而且经过微波处理后的莲房和莲子壳中的原花青素被提取出的含量也是相当的高（与单纯的浸泡相比）。但是利用微波处理后原花青素的结构是否被破坏呢？通过做196nm900nm全波长紫外扫描，判定丙酮没有破坏原花青素的结构，而通过对用1%亚硫酸氢钠提取的原花