Ⅸ型泽蛙（Rana limnocharis）透明骨骼标本制作 毕业论文.doc

本科毕业论文（设计）( 2013届 ) 题 目： 型泽蛙（rana limnocharis）透明骨骼标本制作 学 院： 生命与环境科学学院 专 业： 生物技术 学生姓名： 学号： 20909051039 指导教师： 职称（学位）： 讲师（学士） 合作导师： 职称（学位）： 完成时间： 2013 年 5 月 25 日 成 绩： 综合成绩： 等级： 黄山学院教务处制学位论文原创性声明兹呈交的学位论文，是本人在指导老师指导下独立完成的研究成果。本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在文中以明确方式标明。本人依法享有和承担由此论文而产生的权利和责任。声明人（签名）：年 月 日目 录摘要英文摘要1引言11.1泽蛙的基本特征11.2泽蛙的生物学资料21.3zewa文献回顾31.4本文研究意义32材料和方法42.1材料42.1.1材料的选择42.1.2仪器与器材42.1.3药品的配制42.2方法42.2.1制作的步骤42.2.2观察与摄像53结果53.1透明骨骼标本53.2透明骨骼的测量84讨论94.1实验总结94.2透明骨骼的优点10参考文献10致谢11型泽蛙（rana limnocharis）透明骨骼标本制作 摘要：脊椎动物骨骼标本在教学和科研上都有很大的直观性价值，其制作基本分可为五大步骤：动物的处死；肌肉的剔除；骨骼脱脂；骨骼的漂白；骨骼的整形与装架。而小型脊椎动物(如蛙类和蛇类)骨骼纤细软弱，并且骨骼关节各个部位没有完全骨化，很难将它们处理制成完整的骨骼标本。本文通过改进的透明骨骼染色法，解决了这些难点。.关键词：型泽蛙；透明标本；形态学；骨骼；生物学the production of transparent skeletal specimen of type rana limnocharisdao-zhong qin（20909051039）supervisor: tian huang (lecturer)(college of life and environment sciences， huangshan university， huangshan， 245041 china)abstract: the vertebrate skeleton specimen has a great intuitive value in teaching and researching. the production processes of vertebrate skeleton specimen are generally divided into five steps: animal executing; muscle removing; fat degreasing; bone bleaching; bone plastic. the bones of individual small animals， such as the frogs and snakes， weak and thin， and all parts of the bone and joint are not ossified. its hard for us to make their skeletal specimen integrity. but now， by the improved transparency bone staining， we can solve all these difficulties. key words: type rana limnocharis; transparent specimens; morphology; bone; biological 第 15 页 共 11 页1 引言1.1 泽蛙的基本特征据刘明玉等(2000)介绍，泽蛙(rana limnocharis)如图1-1所示，头宽小于头长；吻端呈尖状；眼间距小于鼻间距；鼻孔位于吻眼之间而且接近吻端；眼睛大；犁骨齿的两小团呈现“v”形，舌后缺存在刻深。蛙趾前端钝尖，半蹼或者2/3蹼；胫跗关节前可达眼。皮肤较为粗糙，没有背侧褶；体背有着多行长短不均匀的纵肤褶。生活时背面为灰棕色、土灰色或者灰绿色，两眼间呈现“v”形斑状，四肢略有深色的横纹，腹面有浅白色或者乳黄色。体长一般为40-50mm，雄蛙存在单咽下外声囊。图1-1 泽蛙外形图1.2 泽蛙的生物学资料泽蛙民间俗称“梆声蛙”、“泥疙瘩”、“乌蟆”、“虾蟆仔”、“田鸡仔”等。泽蛙的分类地位：动物界 fauna 两栖纲 amphibia脊索动物门 chordata 脊椎动物亚门 vertebrata 无尾目 anura蛙科 ranidae蛙属 rana 泽蛙 r.limnocharis。生态习性: 泽蛙的活动期根据我国不同地域而差异较大，长江流域地区一般在3-4月出蛰；广西在2月上旬左右，海南岛则终年可见其田间活动。夜间活动较为频繁，白天和夜晚都可见其觅食，但觅食高潮为凌晨和黄昏时分。主要通过吞食各种昆虫及其幼虫。在高纬度地区，泽蛙在秋季开始冬眠，4月出蜇后开始产卵，繁殖季节延续较长，一年可多次产卵，卵一般会沉入水底。其卵和蝌蚪在稻田内、静水塘或泥坑中生活，适应能力强，发育速度快，食物以浮游生物、藻类、水草及动物尸体与腐殖质为主要供给。（王晓黎等，2007）地理分布: 泽蛙广泛分布在日本与东南亚地区，如图1-2所示。在国内主要分布于秦岭以南的平原和丘陵地带。海拔2000多米的山区也有出没。最为习见，数量颇多。国内的主要分布在山东、西藏、湖南、江苏、浙江、安徽、河北、福建、江西、广西、香港、河南、湖北、陕西、广东、海南、云南、澳门、四川、贵州、台湾、甘肃。（王晶琳等，2006）国外的主要分布为老挝、缅甸、文莱、菲律宾、柬埔寨、孟加拉国、印尼、印度、越南、日本南部岛屿、马来半岛及群岛、尼泊尔、东南亚地区、巴基斯坦、新加坡、斯里兰卡、泰国，不丹也有存在。 图1-2 泽蛙在世界的主要分布图（黑色部分为分布区）1.3 文献回顾在动物生理学方面，ecker a， haslam g(1889)早期就对泽蛙的相关解剖学做过深入的研究。李桑等（2008）通过组织学方法研究了泽蛙原始生殖细胞(性腺分化、pcc劝的迁移、原始性腺的形成)，并探讨了泽蛙性腺分化的差异的原因在条件为不同的培育温度。刘忠全（2003）研究了种群系统地理学和中国泽蛙线粒体基因组结构，从线粒体基因组结构与种群系统地理学两个方面对中国泽现存蛙进行了较为细致全面的探究。陈凤英等（1994）用骨髓细胞制片法，通过比较日本、菲律宾等地区产蛙与广东、四川、安徽产的泽蛙和福建产的泽蛙的染色体组型，研究结果差异明显，得出泽蛙核型具有一定的多样性。在泽蛙的食性方面，许红等（1994）曾初步研究并且发表过泽蛙对中华稻蝗捕食功能的反应。在药理学方面，念宇等（2009）研究了3种农药对泽蛙蝌蚪的急性毒性和联合急性毒性效应。在泽蛙的鸣声方面，姜仕仁等（2006）曾用计算机鸣声分析技术曾对杭州地区泽蛙的鸣声进行过细致的分析。在生态环境研究方面，王晓黎（2007）对研究上海郊区分布的泽蛙的越冬生态环境得出：泽蛙的越冬现象是在自然环境下表现出的正常生理现象，温度是主要的控制因素。在泽蛙的透明骨骼标本及其骨骼系统研究方面，国内也有相关的研究文献，如陈彬等（2002）介绍关于蛇类透明骨骼的制作的方法；冯萍（1995）详细描述了小型脊椎动物和晚期胚胎的透明骨骼的制作过程；吕建伟等（2001）在透明骨骼标本制作也阐述了鱼类透明骨骼标本制作的具体方法；吴慧芳等（2007）在泽蛙色骨骼系统研究的文章中，研究了国内泽蛙(rana limnocharis)的骨骼系统，1.4 本文研究意义蛙类作为环境是否恶化的指示者，对环境污染起到的监测作用。而泽蛙是蛙类中数量与分布最为广泛的一种。是维持整个生态系统健康和稳定不可或缺的生态位。同时泽蛙也是国家重点保护动物之一，可是随着城市化的步伐加剧，泽蛙的栖息地日益缩小，种群数量也正在急剧下降。所以通过制作透明骨骼标本从侧面上为其保护物种的专一性和种群多样性工作提供一定的理论依据。（王晶琳，2006）。本文采用的思路方法为：采用阿利辛蓝(alcian blue 8gs)和茜素红(alizarin red s)分别对泽蛙的软骨和硬骨进行染色，经酒精脱色，最后甘油透明，使其全部的骨骼在不受任何损伤的情况下较为清楚的展现出来，并且对其染色结果进行具体的归纳与剖析，为国内无尾目骨骼系统的研究提供了可靠的借鉴资料。2. 材料和方法2.1 材料2.1.1 材料的选择本文采用的为型泽蛙。采集地点：安徽省黄山市岭南山区周边稻田及沼泽地带。采集时间：2012年4月15日至16日。2.1.2 仪器与器材解剖刀，解剖剪，镊子，电子天平，量筒，烧杯，玻璃棒，放大镜，储存瓶，铁钉，木板，游标卡尺等。2.1.3 药品的配制固定液：95%酒精。软骨染色液：无水乙醇60 ml，冰乙酸试剂40ml，称取20mg阿利辛蓝。硬骨染色液：称取5 mg茜素红，并加0.3 mol/l氢氧化钾100 ml。脱色液：配制梯度升序酒精试剂(25%、50%、75%、100%)。透明液：配制梯度升序丙三醇试剂(25%、50%、75%、100%)。保存液：加入5%的福尔马林的丙三醇溶液。2.2 方法2.2.1 制作的步骤材料的处理：用解剖剪和解剖刀等器具去除泽蛙内脏、眼睛以及有色素沉着的相关结缔组织。在解剖过程中应注意不能将泽蛙颚下的软骨等肌肉组织破坏，尽量使其保持完整。剔除内脏过程中要求清洗干净而且腹壁和骨骼无损伤。材料的固定：将上述活体标本放置固液中固定，用95%酒精固定24h，固定时要利用镊子调整好泽蛙的体态，保持美观，可利于后续的观察研究，一旦标本定形，将可以操作下一步。软骨的染色：先将定型好的标本反复用蒸馏水洗涤3至5次，之后浸泡于蒸馏水中大约12h。最后放入软骨染色液中，不定期观察，当表层软骨(如舌骨、颌下)染成蓝色即可。脱色：将标本置于升序梯度脱色液中，每约24 h换液1次，更换数次后，至泽蛙肌肉变成白色为止。硬骨染色：将取出的标本晾干后，浸没在硬骨染色液当中，至肌肉逐渐成冻状，当见硬骨染成红色既可。透明：将取出的染好的标本依次浸泡在升序梯度透明液中， 每24 h更换透明液1次。保存：将透明好的标本浸于保存液中，放置存储罐中长期保存。维护：应根据泽蛙的体态大小来选择标本存放瓶保存标本，并适量的添加丙三醇纯溶液。当保存液有沉淀物时或出现浑浊时，要及时更换新配置的保存液。原保存液应当用虹吸吸出的方式，禁止用倾倒的方法，为了避免泽蛙标本变形甚至受损。如果标本是置于玻璃瓶中，可以用石蜡密封瓶盖，但是开启时需轻敲周围的封口，或者直接用电吹风烘烤。更换保存液时要将容器注满，但要留空隙。封口的时候要先将瓶盖与瓶口上残留的少许石清除干净，尔后盖严瓶盖。用熔化的石蜡密瓶盖之前，要先也要用电吹风预热涂蜡的地方，这样才保持能封牢。而对于有机玻璃瓶，在顶盖处可以钻出小孔。直径约1至2 毫米即可，用注射器更换或者补充新的保存液，之后将有机玻璃粉末通过三氯甲烷溶解成液体的形态，就可以滴在小孔处方便固化。（霍丽荣等，2004）2.2.2 观察与摄像利用放大镜进行泽蛙的体型及骨骼观察；用数码相机，定期对标本进行拍照；使用photoshop电脑软件对相关图片进行裁剪处理。 3 结果3.1 透明骨骼标本经过上述实验步骤后，较为成功得到了型泽蛙泽蛙透明骨骼标本，基本清晰的展示出泽蛙的骨骼特征，详见图3-1和3-2，型泽蛙透明骨骼标本头骨如图3-3所示，图3-4为型泽蛙头部骨骼模式图。图3-1 型泽蛙整体骨骼背面图图3-2 型泽蛙整体骨骼腹面图图3-3 型泽蛙透明骨骼的头骨（左：背面，右：腹面）图3-4 型泽蛙头骨模式图（左：背面，右：腹面） 对于泽蛙的整体全身骨骼分为中轴骨骼和附肢骨骼两大部分。除头部的蝶筛骨、副蝶骨、脊柱的椎体以及胸部的胸骨外， 其余各骨块都是两侧对称的结构。中轴骨中头骨：颅骨、咽骨(喉头软骨、上下颌骨、舌器)。脊柱：荐椎、胸椎、尾杆骨、颈椎、腰椎。附肢骨中肩带：包括肩胛区及喙区。胸骨：上喙骨、中胸骨、肩胸骨、 上胸骨腰带：由耻骨、坐骨和髂骨3 对骨组成。前肢骨：1) 指骨2) 腕骨3) 前臂骨4) 掌骨5) 肱骨。后肢骨：1) 胫腓骨2) 股骨3) 足4) 跗骨从图3-1和图3-2可以看出，脊柱由10 块椎骨链接而成尾杆骨；腰椎：第58 椎骨；胸椎：第24 椎骨；荐椎：即第9 椎骨； 颈椎：即第1 椎骨。脊柱骨骼全为硬骨组成，染色后均为紫红色，并且染的颜色较深。肩带的肩胛区的后缘由软骨组成染成蓝紫色，基部及前方边缘大半块区为硬骨，为紫红色。下肩胛骨全为硬骨。从锁骨内端沿后缘嵌入锁骨沟槽，喙区的前喙骨为一细长软骨，染成蓝紫色。锁骨、喙状骨都是硬骨。胸骨中骨、上喙骨都为软骨，颜色为蓝色。肩胸骨、中胸骨为硬骨成紫红色。腰带由耻骨、坐骨和髂骨3 对骨组成。而且都为硬骨。前肢骨包括肱骨、前臂骨、腕骨、掌骨、指骨都为硬骨，但是各骨各以韧带密连着韧带部位皆染成蓝色。后肢骨含股骨、胫腓骨、 跗骨、足，都为硬骨，皆被染成紫红色。由图3-3可见，在头骨染色的结果中，颅内软骨， 鼻间软骨，咽骨的上下颌骨局部，舌器及其喉头软骨都为软骨，染色的结果为蓝紫色。其余骨骼为硬骨，染为了紫红色。3.2 透明骨骼的测量经过上述透明骨骼标本，我们可以通过游标卡尺等工具对泽蛙的骨骼进行定量的测量，为动物骨骼学方面提供一定的借鉴资料。图3-5 泽蛙的骨骼模式图注：1.外枕骨；2.前耳骨；3.额顶骨；4.鳞骨；5.翼状骨；6.蝶筛骨； 7.鼻骨；8.方轭骨；9上颌骨；10.前颌骨；11.耳柱骨；12.荐椎；13.尾杆骨；14.上肩胛骨； 15.肱骨；16.桡尺骨；17.腕骨；18.掌骨；19.指骨 20.髂骨；21.股骨；22.胫腓骨；23.距骨；24.跟骨； 25.跖骨；26.趾骨；27.超常数趾骨。用游标卡尺实验测得本组泽蛙的骨骼量度如下表3-1所示。 表3-1 型泽蛙透明骨骼量度表（单位mm）性头骨肱骨臂骨指骨股骨胫骨跗骨趾骨别长宽左右左右左右左右左右左右左右9.1911.156.475.574.615.165.816.0110.5510.2813.2912.886.607.2810.3013.797.7312.046.757.585.436.407.618.6112.5612.4914.2515.138.506.2114.4010.95由表3-1的数据显示，成体泽蛙与形态学描述的泽蛙在度量上存在一定的差距，可能是因为实验组泽蛙的测量数量不够多，体现不了统计学的要求，但从侧面反映了泽蛙种群物种的多样性和地域的差异性以及在特定地域生态位的独特性。4 讨论4.1 实验总结（1）实验涉及光照条件的步骤，光照的强弱会直接影响染色的时间和程度。 （2）在解剖过程中要注意不能损坏蛙的舌器。因为泽蛙的舌器是软骨，很容易损坏。从而可能导致骨骼系统的直接损坏。（3）温度影响本实验标本的制作周期。最适温度在20-30，由于做实验季节正好在春季，不需要温箱等设备。（4）染色时要经常不定期观察，防止软骨染色时染色过度，从而导致不易褪色。硬骨染色时因为naoh有较强的腐蚀性，可能会产生腐蚀过度，而本实验选用低浓度长时间的操作，避免了使标本骨骼脱落的现象。（5）如果透明过程中在组织内可能出现少许气泡，可用针刺破。因为在拍照过程中，气泡会产生折射率，可能会影响拍照的效果。（6）由于泽蛙体积较小，而经过各种药液处理后的标本很软弱，所以在更换各种药液过程中，用镊子时要特别小心，防止破坏或夹断肌肉，更不要把标本损坏。（7）在标本存放时，应该避免阳光直射，否则会影响保存液的清晰，从而影响观察标本的透明度。（8）称取药品时，如果不精确会导致溶液浓度过高或低，所以需要以毫克计量，使得准确掌握染色的大致时间。（9）根据操作的结果可知，本实验基本上制作成功，其过程艰辛而漫长。可以总结为：专注，细心，严谨。4.2 透明骨骼的优点（1）本实验方法避免了解剖工作中人为对泽蛙骨骼的损伤，为骨骼的测量提供准确的数据；（2） 此实验制好的泽蛙标本肌肉呈现无色透明状，其中软骨染为蓝色，硬骨为紫红色，界限比较清晰，容易识别，可以为传统解剖方法提供不宜观察的信息；（3）透明骨骼标本染色法可用于动物骨骼系统、动物内脏器官、血管系统等研究，这为胚胎发育的研究、脊椎动物的解剖方面具有很大的应用价值；（4）透明骨骼制作可以使肌肉完整的保存下来，可以保持骨骼的准确位置与整体形态，避免了在组装骨骼过程中的混乱；（5）透明骨骼标本可用于教学研究，可以形象的展示动物骨骼的肌肉与骨骼系统，使得教学的生动性极大地提高了；（6）透明骨骼标本还存在着观赏价值，在未来的生物市场上存在巨大的经济前景。既作为收藏品，又可以体会制作过程的乐趣。参考文献陈风英，曾科文，王槐，刘玉堂泽蛙的染色体组型研究野生动物，1994，24(06 ) ：40-43陈彬，王跃招介绍一种透明骨骼标本染色法生物学通报，2002，37(4)：57 冯萍介绍一种透明骨骼标本的制作方法川北医学院报，1995，10(04)：76霍丽荣透明骨骼标本的制作、维护及反油和发黄的处理教学仪器与实验，2004，31(2)：30-31 姜仕仁，丁平 实验条件下社鼠个体相遇时的叫声特征动物学研究， 2006，22(01)：11-25李桑，尤永隆，林丹军泽蛙的性腺分化及温度对性别决定的影响动物学报，2008，(02)：1-65刘忠全中国泽蛙线粒体基因组结构及种群系统地理学研究南京：南京师范大学生命科学学院2003，10-30刘明玉，解玉浩，季达明中国脊椎动物大全沈阳：辽宁大学出版社2000：13-69吕建伟，徐兴军，王雪松，李铁透明骨骼标本制作高师理科