基因芯片技术及其应用

基因芯片技术及其应用 郑敏 （临沂大学生命科学学院，山东 临沂 276000） 摘要 基因芯片(DNA 芯片,微阵列)是 20 世纪后期在杂交理论基础上发展起来的又一个分 子生物学技术.将大量的核苷酸探针以点阵列方式排列于特定的固相支持物上,与放射性或荧 光标记的样品靶 DNA 杂交,通过激光共聚焦等技术来分析靶 DNA 的存在和量的方法.基因 芯片技术已基本实现了自动化,应用于功能基因研究、杂交测序、药物筛选诊断、基因表达、 基因多态性和突变检测等,在生物学、医学、制药学、环境保护学和农林业等领域上都有极 为广阔的应用前景。 .关键词 基因芯片；微阵列；分子生物学；基因表达 基因芯片（genechip ）是生物芯片（ biochip）的一种，又称 DNA 芯片、DNA 微阵列 （DNA microarray） 、寡核苷酸阵列（oligonucleotide array） ，是 20 世纪 90 年代初随着人类 基因组计划的发展而兴起的技术。基因芯片是按预先设计的阵列方式，把大量核酸片段固 定在载体基片上，组成密集的按序排列的探针集群，通过与标记样品核酸杂交，检测其杂 交信号，从而达到判断靶核酸的有无或数量的目的 1.基因芯片技术室当今生命科学领域集 微电子学、生物学、化学、计算机科学于一体的高度交叉的一项尖端应用型新技术，现已 成为国际上的前沿和热点 2。现将基因芯片技术及其应用作一综述。 1 基因芯片技术的产生和发展 21 世纪将是生命科学的世纪, 基因芯片技术是近年产生的一项生物高新技术, 它将像 计算机一样成为 21 世纪即将来临的又一次新兴革命的奠基石 3.4。基因芯片技术的产生与 发展与人类基因组计划(Human Genome Project, HGP) 的研究密不可分 5。人类基因组的大 量信息需要有一种快速、敏感、平行检测的技术,随着越来越多的基因被解码, 基因的功能 研究成为迫切需要解决的课题。在这一背景下, 以基因芯片技术为主体的生物芯片诞生了, 它被誉为是 20 世纪 90 年代中期以来影响最深远的重大科技进展之一。基因芯片技术充 分结合并灵活运用了寡核苷酸合成、固相合成、PCR 技术、探针标记、分子杂交、大规模 集成电路制造技术、荧光显微检测、生物传感器及计算机控制和图像处理等多种技术, 体 现了生物技术与其他学科相结合的巨大潜力。 基因芯片技术的理论基础是核酸杂交理论, Southern 印迹可以看作是生物芯片的雏形 ; 其后, 人们又发明了一个以膜片为介质基础的克隆库扫描技术, 引入了克隆与杂交型号相对 应的概念, 在此基础上, 分格筛选技术得到了应用; 1989 年 Ed Southern 提出了利用在玻片 表面固定的核苷酸探针进行基因序列测定的实验设计; 而真正使基因芯片技术发展并实用 化的, 是得益于非孔固相支持介质的使用和高密度原位合成核苷酸两项技术的发明, 从而推 进了基因芯片产品的商业化。在美国硅谷, 1991 年 Affymax 公司开始了生物芯片的研制, 1992 年从 Affymax 派生出来的世界上第一家专门生产生物芯片的公司 Affymetrix 宣告 成立。Forder( 现任 Affymetrix 总裁) 及其同事在 20 世纪 90 年代初发明了一种利用光 刻技术在固相支持物上光导合成多肽的方法, 在此基础上于 1993 年设计了一种寡核苷酸 生物芯片, 1996 年制造出了第一块商业化的基因芯片。1994 年在美国能源部防御研究计划 署、俄国科学院和俄国人类基因组计划 1 000 多万美元的资助下研制出了一种生物芯片, 用于检测 - 地中海贫血病人血样的基因突变。1998 年美国的纳米基因公司(Nanogen) 利用生物芯片在世界上构建了首例缩微芯片实验室, 该成果被美国期刊选入 1998 年世界 10 大科技突破之中。 最近几年, 国际上掀起了基因芯片设计热潮, 使基因芯片技术得到不断完善和发展, 出 现了多种芯片技术。最初的芯片主要目标是用于 DNA 序列的测定、基因表达图谱鉴定及 基因突变体的监测和分析, 因此称为基因芯片。但目前这一技术已扩展到非核酸领域, 如已 出现了蛋白质芯片分析技术、Biacore 技术和丝网印刷技术等。在这一发展趋势下, 芯片技 术现多被称为生物芯片技术。根据芯片上固定的探针的不同, 可将生物芯片分为基因芯片、 蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片等; 根据原理的不同, 可以分为元件型微阵列芯片、通道 型微阵列芯片、生物传感芯片等新型生物芯片; 根据所进行的反应过程 , 可将生物芯片分为 生物样品的制备芯片、PCR 芯片、毛细管电泳芯片及 PCR 毛细管电泳芯片等 6-9。 2 基因芯片的原理 基因芯片是利用核酸杂交原理来检测未知分子的.其基本原理是首先将一定规模的核酸片段 (cDNA、EST 或寡聚核苷酸)作为识别分子,按预先设置的排列固定于一种特定的固相支持 载体(纤维素、硝酸纤维素、尼龙、硅片、金片及载玻片等) 的表面,利用基因的碱基配对原 理和印迹杂交技术等,与来自不同细胞、组织或整个器官的 mRNA 反转录生成的第一链的 探针杂交,通过特殊的检测系统来分析各种生物分子存在的量的一种技术.基因芯片具有可同 时并行分析成千上万种生物分子的优点,并有可自动化、微型化的特点.非常适合于基因诊断 和表达分析等. 3 基因芯片技术 基因芯片技术可分解为 DNA 阵列的构建和印制、探针靶的制备、杂交和检测、数据收集 与分析 4 个主要部分. 3.1 DNA 阵列的构建和印制 根据芯片种类的应用目的的不同,芯片核酸阵列的构建方式也不相同.首先是根据研究目的选 用合适的寡核苷酸、cDNA 片段或特定的功能基因等,按统计方式事先构建成点阵列.然后, 将所需用的核酸片段就位合成于芯片上,或以大致相当的浓度,变性后采用手工或机械的方法,按 一定的排列方式点样在特定的固相支持物上,前者称为原位合成,后者可有压电打印和直接点 样两种方法. 3.2 靶样品的准备 靶样品就是 DNA 样品,主要来源是从生物细胞中提取 mRNA 后经转录成 cDNA,通常采用常 规的基因分离、反转录、扩增的标记等.为了获得杂交信号,在扩增过中加同位素或化学荧光 进行标记.同位素常用 P32/P33/S35.使用 Cy3-dUTP、Cy5-dUTP 等荧光标记,没有同位素的放 射危险性,通过激光共聚焦扫描仪器寻址测读,具有很高的分辨能力、极高的灵敏度和定位功 能,是目前广泛用于芯片杂交结果判读的标记方法.荧光标记染料已开发出了数 10 种. 3.3 杂交和检测 杂交条件的选择与研究目的有关.如进行多态性分析或基因测序时杂交要求比较严谨;表达检 测时则需要较长的杂交时间,较高的样品浓度及较低的杂交温度;突变检测主要是鉴别单碱基 的错配,需时较短,但杂交严谨度要求更高.通常探针靶样品与芯片进行杂交 1218 h.探针质 量对杂交结果有很大影响,经纯化的探针与芯片杂交结果的信噪比低,阳性信号比较强.杂交 后要进行严谨漂洗程序.检测主要是将用于标记的放射性或荧光标记等,通过放射自显影或激 光共聚焦显微镜扫描来检测杂交信号的强弱和分布. 3.4 数据收集和分析 将经荧光或激光共聚焦扫描得到的图像输入计算机,按不同的研究目的,用专门软件对杂交产 生的印迹进行数据的自动化处理和定量分析.其基本步骤为样品斑点的确定、图像背景的识 别和扣除,所得的数据经正态化后,进行统计分析,得到基因的表达图谱 10。 4 基因芯片的应用前景 4.1 DNA 序列测定 序列测定是最初发展基因芯片技术的动力之一.经典的测序是用 Sanger 和 Maxan-Gilbert 方 法,但其效率、费用和可靠性远不能满足大规模测序的要求,随着人类基因组计划(HGP)的实 施,开发了杂交测序(SBH)方法,例如,通过将未知序列与大量的短链寡聚核苷酸集合杂交重建 目标 DNA 序列,用 65 536 个寡聚核苷酸阵列 ,可测定 200 bp 长的 DNA 序列,用 67 108 864 个寡聚核苷酸阵列,可测定数千个 bp 长的 DNA 序列.Ha-cia 等用含有 48 000 个寡聚核苷酸 的高密度微阵列分析了黑猩猩与人 BRCAI 基因序列差异,结果发现在外显子 11 约 3.4 kb 长 度范围内的核苷酸序列同源性在 98.2%83.5% 之间,高度显示了二者在进化上的相似性 11. MurkChee 等人用含有 13 500 个探针的序列测定了全长为 16.6 kb 的人类线粒体基因序列,准 确率高达 99%. 4.2 基因表达水平的检测 以 DNA、cDNA 或寡核苷酸为探针制备的 DNA 芯片, 可直接平行检测大量 mRNA 的丰度, 而应用于基因表达的研究。基因芯片应用于基因水平检测的最大优越性是可以自 动、快速检测目的材料中成千上万个基因的表达情况, 这是常见的基因表达水平检测法不 可比的。目前, 基因芯片技术已在部分植物、细菌、真菌的整个基因组范围内对基因表达 水平进行了快速检测, 该技术还可用于检测各种生理、病理条件下人类所有基因表达的状 况。 4.3 基因点突变及多态性检测 可根据已知基因的序列信息设计出含有成千上万不同寡核苷酸探针的 DNA 芯片, 再用荧 光标记待测 DNA, 如二者完全匹配则杂交后结合牢固, 荧光强度高, 如不完全匹配则荧光 强度弱或无, 由此可判断点突变的存在与否及部位和个数。如对 N 个碱基长度序列的每个 碱基进行筛查, 则需 4N 个探针即可。一般 1.28 cm 的支持物上可载 16 000 个探针, 可用 于 4 000 kb 碱基序列的筛查。 4.4 寻找可能致病的基因和疾病相关基因 用 cDNA 微阵列技术通过比较组织细胞基因的表达谱差异, 可以发现可能致病的基因或疾 病相关基因, 实现对疾病快速、简便、高效的诊断。基因诊断是基因芯片最具商业价值的 应用。Affymetrix 公司把 p53 基因( 一个重要的肿瘤抑制基因 , 很多肿瘤都是因该基因突 变引起的) 的全长序列和已知突变的探针集成在芯片上 , 利用它来实现对癌症的早期诊断。 4.5 发现新基因 基因芯片技术为大规模的新基因发现提供了一条快速有效的路线。随着基因组序列的阐明, 鉴定大量未知功能的基因、对基因功能的大规模分析将成为后基因组研究的重点。 4.6 生物信息学研究 人类基因组计划已经完成, 目前的问题是面对大量的基因组序列或基因片段序列, 如何研究 其功能。后基因组计划和蛋白质组计划等就是为破译各基因的功能而提出的。基因的功能 并不是独立的, 一个基因表达的上调或下调往往会影响上游和下游几个基因表达状态的改 变, 从而会进一步引起和这几个基因相关的更多基因的表达模式的改变。基因之间的这种 复杂的相互作用组成了一张交错复杂的立体关系网。这就需要我们站在更高的层次全面地 理解基因间的相互关系, 全面了解不同个体基因变异, 以及不同组织、不同时间、不同生命 状态等的基因表达差异信息, 并总结出其中的规律。生物信息学将在基因间复杂关系的研 究中发挥重要作用, 而基因芯片技术能使我们对生物信息的采集和分析成为可能, 它必将成 为未来基因组信息学研究的主要支撑技术。 4.7 蛋白质组学、基因组文库 DNA 芯片的应用有助于提高阐明细胞中蛋白质间的相互作用及鉴定配体结合蛋白质的速 度。DNA 芯片可通过鉴定重叠克隆的顺序来对基因组文库做图。 5 基因芯片技术展望 芯片技术的发展历史很短, 虽然还存在一些问题, 但它已在基因表达分析、基因诊断、药物 筛选、序列分析等诸多领域呈现了广阔的应用前景, 而且在农业、工业, 以及食品、环境监 测等方面也表现出极大的应用潜力。基因芯片技术的迅速发展和应用已引起各方面的广泛 关注, 许多实验室、公司都在大力开发和应用此项技术, 在制作、检测设备及计算机软件等 方面均投入了大量的人力和物力进行研究和开发。可以预见, 随着研究的不断深入和技术 的更加完善, 基因芯片技术的应用将更加广泛, 一定会在生命科学研究领域发挥巨大的作用。 参考文献 1 安利峰，胜利.基因芯片及其应用前景，西北民族学院学报， 2002,23(6):4042. 2 翟新验，刘钧.基因技术的应用前景.当代畜牧，2003,6:41,43. 3 Brow P, Hartwell L. 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