仔猪粪便中乳酸菌的分离、鉴定及其抑菌特性的研究

仔猪粪便中乳酸菌的分离、鉴定及其抑菌特性的研究 张素辉 曹国文 徐登峰 王孝友 蒋 安 摘 要 从健康仔猪新鲜粪便中分离到 3 株乳酸菌，并对其进行了属和种的生化鉴定，结果显示，菌株 La 与 Lt 均为嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus），Ls 为乳酸乳杆菌（Lactobacillus lactis）。 对分离的 3 株乳酸菌的代谢产物进行了体外抑菌试验研究，结果表明，3 株乳酸菌的代谢产物对大肠杆菌 、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌都有较明显的抑制作用；对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好，沙门氏菌次之 ，对大肠杆菌的抑菌效果相对较弱。 仔猪腹泻是引起仔猪生长受阻和死亡的重要原因之一，一直是困扰养猪业发展的难题。据资料统计，我国 仔猪死亡率为 1525%，2 周龄以内死亡率为 26%，24 周龄的死亡率为 16%，断奶前后因腹泻死亡的 数量占总死亡数量的 49.11%1。以前常采用在断奶仔猪饲粮中添加抗生素的办法来控制腹泻，但抗生素 在抑制致病性微生物的同时，也破坏了动物体内微生物菌群的平衡，增加了消化道疾病的发生。同时病原 体的耐药性问题越来越严重，部分抗菌药物在畜产品中的残留对人类健康构成极大威胁。因此，研究和开 发无毒、无副作用和无残留的生物药品已成为热点课题。近年来,微生态制剂越来越受到众多人士的青睐, 微生态调节剂是根据微生态学原理,调整微生态平衡的制剂。微生态疗法是根据微生态学原理,用微生态制 剂扶持和恢复肠道菌群的平衡以达到预防腹泻的目的。1998 年 AAFCO 年鉴公布了 43 种可用作益生素的菌 种,其中半数以上是乳酸菌(Lactic acid baciteria)2。乳酸菌在益生菌制剂的研究和生产中扮演着重 要的角色。本研究的目的是从健康仔猪的新鲜粪便中分离出在体外具有广谱抑菌、杀菌效果好的乳酸菌菌 株，从而为开发应用于防治仔猪腹泻性疾病的微生态制剂提供参考依据。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 样品 健康仔猪新鲜粪便，采自多个规模化养猪场。 1.1.2 培养基 增菌及分离培养基：改良的 MRS 培养基，其组成为牛肉膏 1.0 g、胰蛋白胨 0.5 g、酵母浸出粉 0.5 g、 葡萄糖 1.5 g、乳糖 0.5 g、5%半胱氨酸 1.0 ml、吐温-80 0.1 ml、氯化镁 0.05 g、柠檬酸铁铵 0.2 g、 硫酸锰 0.005 g、乙酸钠 0.5 g、琼脂粉 1.4 g、无水磷酸氢二钠 0.2 g、100 ml 蒸馏水，调 pH 值至 5.4 。 微量生化鉴定管:购自杭州微生物试剂有限公司。 1.2 方法 1.2.1 菌株的分离 在改良的 MRS 液体培养基中加入适量的新鲜仔猪粪便，富集培养 24 h 后,用接种环取培养液划线接种于改 良的 MRS 琼脂平皿中,37 有氧培养 4872 h,挑取形态及颜色各异的菌落分别划线接种作纯培养，并进 行镜检，观察分离细菌的颜色及形态特征。 1.2.2 分离菌的鉴定 挑取平板上纯培养的革兰氏阳性无芽孢杆菌，作硝酸盐还原试验、明胶液化试验、过氧化氢酶试验，靛基 质试验和硫化氢试验；作七叶苷、纤维二糖、麦芽糖、甘露醇、水杨苷、山梨醇和蔗糖发酵试验。 1.2.3 乳酸菌对常见肠道致病菌的抑菌试验 乳酸菌新鲜培养液按 2%(v/v)接种于 MRS 液体培养基中,静置培养 1824 h,取适量培养液,5 000 r/min 离心 30 min，吸取上清液备用。 临床分离保存的大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌经活化后,接种于普通肉汤中培养 12 h,用灭菌吸 管分别吸取各菌液培养物 0.5 ml 于普通营养平皿中,用 L 棒均匀涂布,待琼脂表面水分干燥后,在平板表面 放置灭菌的牛津杯,取制备的乳酸菌上清液于牛津杯内测定其对常见肠道病原菌(大肠杆菌、沙门氏菌和金 黄色葡萄球菌)的抑菌活性,置 37 培养 10 h，观察并测定抑菌圈的大小。同时设立相应代谢产物 pH 值 相同的 MRS 液体培养基作对照。 判定标准为：抑菌圈直径 4 mm 判定为不敏感；抑菌圈直径 510 mm 判定为低度敏感；抑菌圈直径 11 15 mm 判定为中度敏感；抑菌圈直径大于 15 mm 判定为高度敏感3。 2 结果 2.1 各菌株特征 本试验分离得到 3 株乳酸菌，编号分别为 La、Ls、Lt，其菌落特征、菌体形态及染色特征见表 1。 2.2 各菌株的鉴定 根据革兰氏染色镜检可知，La、Ls、Lt 菌为革兰氏阳性的无芽孢杆菌。生化试验表明，它们均不能利用 硝酸盐、过氧化氢酶试验和靛基质试验呈阴性，不液化明胶，不产生硫化氢。依据这些菌株糖发酵试验的 结果(见表 2)，并参见伯杰细菌鉴定手册(第八版)4，最终鉴定为：菌株 La 为嗜酸乳杆菌(Lactoba cillus acidophilus)，菌株 Ls 为乳酸乳杆菌（Lactobacillus lactis），菌株 Lt 为嗜酸乳杆菌（Lacto bacillus acidophilus）。 2.3 乳酸菌代谢产物对常见肠道致病菌的抑菌试验结果（见表 3） 由表 3 可以看出,3 株乳酸菌代谢产物对 3 株病原指示菌都有较强的抑制作用,所有菌株对金黄色葡萄球菌 的抑菌效果最好,抑菌圈直径在 1823 mm 之间,各菌株抑菌圈直径由大到小依次为 LsLtLa;对沙门氏菌 的抑制效果相对较低,抑菌圈直径在 1417 mm 之间,各菌株抑菌圈直径由大到小依次为 LsLaLt；对大 肠杆菌抑菌圈直径在 1519 mm 之间，各菌株抑菌圈直径由大到小依次为 LsLaLt。 比较 La、Ls、Lt 菌株对沙门氏菌抑菌效果发现，Ls 菌株代谢产物的抑制效果最明显，其抑菌圈直径极显 著大于 La、Lt 菌株（P0.01）；La 菌株对沙门氏菌的抑制作用高于 Lt 菌株，差异显著（P0.05）。La 、Ls、Lt 菌株对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌效果均存在极显著差异（P0.01）。 3 讨论 目前，许多报道显示,微生态制剂不但能提高机体的生长性能5，而且还能降低肠杆菌科细菌在胃肠道各 部位定植水平而影响肠道菌群的微生态平衡6，专业人士越来越多地注意到饲喂乳酸菌微生态制剂能够 影响肠道菌群的微生态平衡。Van Schie 等(1987)认为,乳酸杆菌的乳酸和挥发性脂肪酸在降低肠杆菌科 细菌,如沙门氏菌在肠道定植具有重要作用7。乳酸菌在培养过程中可以产生有机酸(如挥发性脂肪酸、 乳酸、丁酸、醋酸等)、双乙酰、过氧化氢、细菌素等化合物，这 4 个要素均能独自地或共同地作用于胃 肠道菌群，这些混合物的分子量、生物化学性质、抑菌范围各不相同。 人们对乳酸菌益生素的研究主要集中在采用新方法分离或开发新的益生素菌种上。陈世琼等认为，从菌种 的安全性以及对宿主肠道的粘附性考虑，益生素菌种最好采用分离自宿主肠道优势菌中的优良菌种；另外 ，为节约生产和技术成本，应从宿主体内分离耐氧的菌种8。当然也可使用改造后仍然安全的菌种，但 需作毒理学试验验证其安全性。本研究采用改良的 MRS 培养基，因含有高浓度的乙酸盐离子，低 pH 值(5. 4)，并有刺激因子吐温-80，可抑制其它许多微生物的生长，起到选择培养的作用，因而能从粪便这样的 复杂区系中选择培养出乳酸菌。在整个培养过程中均采取有氧培养，分离出的乳酸菌为兼性厌氧菌，为今 后的研究和生产减去了较为复杂的厌氧培养条件。 乳酸菌的代谢产物通过影响有害菌的定植粘附及抑制其生长而达到保护机体的作用9，这些代谢产物可 以是低分子量或者高分子复合物,后者被认为是质粒编码的蛋白质,即细菌素,目前已经有许多关于乳酸菌 细菌素的报道10，11。本试验在筛选出 1 株乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis),2 株嗜酸乳杆菌(Lact obacillus acidophilus)的基础上，通过牛津杯平板扩散试验对所分离到的乳酸菌菌株进行体外抑菌试验 ，发现所分离的 3 株乳酸菌发酵上清液有较强的抑菌活性，而相同 pH 值条件下的 MRS 培养基液在相同条 件下没有抑菌活性，从而排除了酸的作用。这与