体外培养人羊膜上皮细胞的表型及分化能力

中国组织工程研究 第 18 卷 第 2 期 20140108 出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research January 8, 2014 Vol.18, No.2 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 211 www.CRTER.org 连建春，男，1986 年生， 山西省大同市人，汉 族， 大连医科大学在读硕士， 主要从事干细胞生物学以 及生物材料研究。 并列第一作者：刘洋，男， 1979 年生，辽宁省昌图县 人，汉族，2007 年大 连理 工大学毕业，博士，副研 究员，主要从事(干)细胞 生物学、生物材料以及组 织工程研究。 通讯作者：孙广炜，博士， 副研究员，中国科学院大 连化学物理研究所生物医 用材料工程组，辽宁省大 连市 116023 并列通讯作者：贺欣， 硕士， 副教授，大连医科大学 检 验医学院，辽宁省大 连市 116044 doi:10.3969/j.issn.2095-4344. 2014.02.009 中图分类号:R318 文献标识码:B 文章编号:2095-4344 (2014)02-00211-07 稿件接受：2013-10-16 体外培养人羊膜上皮细胞的表型及分化能力 连建春 1，刘 洋 2，刘 畅 2, 3，吕世杰 4，郭 昕 2，南 丰 5，孙广炜 2，贺 欣 1，马小军 2 (1大连医科大学检验医学院，辽宁省大连市 116044；2中国科学院大 连化学物理研究所生物医用材料工程组， 辽宁省大连市 116023；3中国科学院大学，北京市 100049；4大连市妇 产医院，辽宁省大 连市 116021；5大连医科大学附属第二医院骨科， 辽宁省大连市 116023) 文章亮点： 1 实验分析了体外培养对羊膜上皮细胞表型以及分化能力的影响，探讨原代羊膜上皮细胞干性标志物 SSEA-4 的表达水平与体外培养后羊膜上皮细胞表型以及分化能力变化的关联性。 2 结果提示需要建立临床样本筛选指标以实现羊膜上皮细胞的质量监控；需要继续优化培养条件以维持体 外培养过程中 SSEA-4 等干性标志物的高表达；羊膜上皮细胞的向心肌样细胞分化的能力受到个体差异与 培养条件的影响，还需要进一步探讨。 关键词： 组织构建；组织工程；羊膜上皮细胞；体外培养； SSEA-4；羊膜上皮细胞标志物；心肌样细胞分化；国家 自然科学基金 主题词： 干细胞；羊膜；上皮细胞；细胞分化；肌细胞 , 心脏；抗原 , 表面 基金资助： 国家自然科学基金 (31271055)：模拟细胞微环境强化干细胞体外定向预分化体系的研究及其工程化构建；国 家自然科学基金 (81101757)：利于肿瘤干细胞扩增的基质刚度与乏氧微环境的构建及调控。国家自然科学基 金 (21076207)：细胞间质体外模拟系统的构建及物质传递基本规律的研究。国家科技重大专项 (2012ZX10002-011-013)：肝癌细胞三维培养模型标准化构建和规模化制备技术研究；大连市科学技术基金 (2012J21DW029)：体外肿瘤干细胞培养体系的建立及应用 摘要 背景：人羊膜上皮细胞具有多系分化能力，是再生医学中重要的细胞来源。目前的研究多集中于对其分化能 力的考察，而体外培养过程中羊膜上皮细胞的生物学特征如何变化尚不清楚。 目的：分析体外培养对人羊膜上皮细胞生长、表型及向心肌样细胞分化的能力等生物学特性的影响，探讨原 代人羊膜上皮细胞干性标志物 SSEA-4 的表达水平与人羊膜上皮细胞生物学特性变化之间的关联性。 方法：使用统一分离方法获得原代羊膜上皮细胞并进行体外培养。利用 CCK-8、流式细胞仪及 real-time PCR 等手段检测不同培养阶段人羊膜上皮细胞的增殖、表型以及向心肌样细胞分化的能力。 结果与结论：不同胎儿样本来源的原代人羊膜上皮细胞的 SSEA-4 表达在 26.7%-97%，存在很大的个体差 异。并且，随着传代次数的增加，人羊膜上皮细胞的 SSEA-4 表达水平显著降低，其下降程度与原代 SSEA-4 的表达水平无关。另外，培养后人羊膜上皮细胞的心肌分化潜能也存在很大个体差异，且其差异与 原代人羊膜上皮细胞的 SSEA-4 表达水平的高低无关。结果提示，不同胎儿样本来源的原代人羊膜上皮细胞 的 SSEA-4 表达水平受到个体差异的影响，需要建立更准确的临床样本筛选指标来稳定获得原代高表达 SSEA-4 的胎儿样本，以实现对人羊膜上皮细胞的质量监控。另外，体外培养过程中 SSEA-4 的表达水平受 到培养条件的影响，需要继续优化培养条件以维持其高表达。此外，人羊膜上皮细胞向心肌样细胞分化的能 力受到样本个体差异以及培养条件的影响，在今后还需要进一步研究。 连建春，刘洋，刘畅，吕世杰，郭昕，南丰，孙广炜，贺欣，马小军 . 体外培养人羊膜上皮细胞的表型及分 化能力 J.中国组织工程研究， 2014， 18(2):211-217. Phenotype and differentiation capacity of human amniotic epithelial cells cultured in vitro Lian Jian-chun1, Liu Yang2, Liu Chang2, 3, Lv Shi-jie4, Guo Xin2, Nan Feng5, Sun Guang-wei2, He Xin1, Ma Xiao-jun2 (1The Laboratory Medical College, Dalian Medical University, Dalian 116044, Liaoning Province, China; 2Laboratory of Biomedical Material Engineering, Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023, Liaoning Province, China; 3University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 4Dalian Maternity Hospital, Dalian 116021, Liaoning Province, China; 5Department of Orthopedics, the Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116023, Liaoning Province, China) Abstract BACKGROUND: Human amniotic epithelial cells are an important source of cells in regenerative medicine as its 连建春，等 . 体外培养人羊膜上皮细胞的表型及分化能力 P.O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org212 www.CRTER.org Lian Jian-chun, Studying for masters degree, the Laboratory Medical College, Dalian Medical University, Dalian 116044, Liaoning Province, China Liu Yang, Doctor, Associate investigator, Laboratory of Biomedical Material Engineering, Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023, Liaoning Province, China Lian Jian-chun and Liu Yang contributed equally to this paper. Corresponding author: Sun Guang-wei, Doctor, Associate investigator, Laboratory of Biomedical Material Engineering, Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023, Liaoning Province, China Corresponding author: He Xin, Master, Associate professor, the Laboratory Medical College, Dalian Medical University, Dalian 116044, Liaoning Province, China Accepted: 2013-10-16 multipotentation, but new studies mainly focused on differentiation features and there were little research oneffect of culture in vitro on biological property of amniotic epithelial cells. OBJECTIVE: To analyze the effects of in vitro culture on growth, cell phenotype and differentiation capacity of human amniotic epithelial cells into cardiomyocyte-like cells, and explore the correlation of primarily cultured human amniotic epithelial cells marker SSEA-4 expression level and the change of biological characteristics of human amniotic epithelial cells. METHODS: Primarily cultured human amniotic epithelial cells were obtained from amniotic tissues by using the same separation protocol. Human amniotic epithelial cells were cultured in vitro. The proliferation, cell phenotype and the differentiation capacity of human amniotic epithelial cells into cardiomyocyte-like cells were evaluated by means of cell counting kit-8, flow cytometry and real-time PCR. RESULTS AND CONCLUSION: The SSEA-4 positive cells in primarily cultured human amniotic epithelial cells from different fetal tissues were between 26.7%-97%, which indicated that there was great individual difference among amniotic tissue samples. Moreover, with passage, the SSEA-4 expression in human amniotic epithelial cells decreased significantly, which did not correlate with the SSEA-4 expression in primarily cultured human amniotic epithelial cells. Results indicated that there was great individual difference in SSEA-4 expression level in primarily cultured human amniotic epithelial cells from different amniotic tissue samples. Thus, it is necessary to set up clinical screening indexes to get samples with higher SSEA-4 expression stably and to control the quality of human amniotic epithelial cells. In addition, during culture period, SSEA-4 expression level was affected by culture conditions. The culture conditions of human amniotic epithelial cells should be optimized to maintain SSEA-4 expression at a high level. In addition, the differentiation capacity of human amniotic epithelial cells into cardiomyocyte-like cells was also affected by individual difference among different samples and culture conditions, which will be further studied in the future. Subject headings: stem cells; amnion; epithelial cells; cell differentiation; myocytes, cardiac; antigens, surface Funding: the National Natural Science Foundation of China, No. 31271055, 81101757, 21076207; the National Key Science and Technology Project of China, No. 2012ZX10002-011-013; Science and Technology Foundation of Dalian, No. 2012J21DW029 Lian JC, Liu Y, Liu C, Lv SJ, Guo X, Nan F, Sun GW, He X, Ma XJ. Phenotype and differentiation capacity of human amniotic epithelial cells cultured in vitro. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2014;18(2):211-217. 0 引言 Introduction 羊 膜 是 胎 盘 的 重 要 组 成 部 分 之 一 ， 由 羊 膜 上 皮 细 胞 层 、 基 底 膜 及 间 充 质 细 胞 层 组 成 1-2。 人 羊 膜 上 皮 细 胞 作 为 一 种 干 细 胞 ， 表 达 SSEA-4 等 干 性 标 记 物 ， 同 时 具 有 向 心 肌 、 肝 以 及 胰 岛 细 胞 等 多 系 分 化 的 潜 力 3-6， 另 外 ， 人 羊 膜 上 皮 细 胞 来 自 临 床 废 弃 物 ， 且 免 疫 原 性 低 ， 使 用 人 羊 膜 上 皮 细 胞 不 会 给 供 者 带 来 痛 苦 ， 不 存 在 伦 理 问 题 ， 适 合 异 体 移 植 7-8， 因 此 人 羊 膜 上 皮 细 胞 具 有 广 泛 的 临 床 应 用 前 景 9-11。 此 外 ， 除 了 造 血 干 细 胞 、 间 充 质 干 细 胞 ， 近 年 来 国 内 脐 血 库 也 开 始 收 集 和 保 存 羊 膜 上 皮 细 胞 ， 其 不 断 增 长 的 样 本 数 量 和 标 准 化 样 本 处 理 流 程 为 未 来 羊 膜 上 皮 细 胞 的 大 规 模 临 床 应 用 奠 定 了 重 要 的 产 业 化 基 础 12-14。 但是，单份胎儿羊膜样本所获得的干细胞 数量有限，为了满足干细胞移植治疗的目的， 需要对干细胞进行体外培养 15。但是，研究发 现体外培养过程会对胎儿来源干细胞的生物学 特性造成一定的影响，如脐带来源间充质干细 胞随着传代次数的增加出现了明显的衰老，并 且其向成骨、脂肪以及心肌细胞的分化能力发 生了明显改变 17-19。对于人羊膜上皮细胞，目 前的研究多集中在对其分化能力的考察 20-24， 关于体外培养过程中人羊膜上皮细胞的表型和 分化能力等生物学特性变化的研究还比较少。 另外，SSEA-4作为一个主要的人羊膜上皮细 胞干性标志物，其表达水平是否与人羊膜上 皮细胞生物学特征变化具有一定的内在联系 还不明确。因此，实验初步考察了体外培养 对人羊膜上皮细胞表型及分化能力的影响， 着重探讨了原代人羊膜上皮细胞的SSEA-4表 达水平与人羊膜上皮细胞生物学特性变化之 间的关联性，从而为人羊膜上皮细胞的生物 学研究以及未来的临床应用提供了一定的依 据。 1 材料和方法 Materials and methods 设计：细胞学水平，对比实验。 时间及地点：于2012年10 月至2013 年7 月在中国科学院大连化学物理研究所生物医 用材料工程组完成。 材料：8例人羊膜组织样本来自大连市妇 产医院。实验获得了大连市妇产医院伦理委 员会的批准，相关孕妇均签署了知情同意书。 提供样本的孕妇无合并症及并发症，均采用 阴道分娩方式。由协和干细胞基因工程有限 公司大连分公司统一将人羊膜上皮细胞由羊 膜组织中分离，并获得原代人羊膜上皮细胞。 连建春，等 . 体外培养人羊膜上皮细胞的表型及分化能力 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 213 www.CRTER.org 实验方法： 人羊膜上皮细胞的传代培养 ：当人羊膜上皮细胞生长至90%融合时， 使用PBS 洗涤，之 后用0.25%胰蛋白酶(含0.02% EDTA)于37 消化3 min， 然后加入培养基终止胰蛋白酶作用，之后1 000 r/min离心 5 min，弃上清，细胞沉淀用培养基重新悬浮后，按照 12的比例进行传代培养。每3 d更换新鲜培养液，使用 相差显微镜观察细胞形态。 人羊膜上皮细胞的增殖检测 ：按照CCK-8试剂的说明， 将细胞接种于96孔培养板，接种密度为410 3/cm2。每天 更换新鲜培养基，并取3个平行孔加入含 20 L CCK-8的 培养基200 L/well，于培养箱内孵育1 h后，用酶标仪测 定每孔的吸光度，测定波长为450 nm，参考波长为630 nm。 人羊膜上皮细胞的表型鉴定 ：将对数生长期的人羊膜 上皮细胞用胰蛋白酶消化并洗涤后，细胞浓度均调至1 109 L-1。取细胞悬液 200 L，加入荧光标记单抗3 L混匀， 在室温下避光孵育30 min洗涤后用流式细胞仪检测，以 mouse IgG-FITC、IgG-PE作为阴性对照。 人羊膜上皮细胞的心肌诱导 ：参照文献报道的方法进 行心肌诱导 8，将第 2代人羊膜上皮细胞以 104/cm2的密度 接种于培养瓶中，加入含有体积分数10%胎牛血清的 RPMI 1640培养液培养48 h后，更换为含有 1 mmol/L抗坏 血酸磷酸钠的分化培养液，继续培养14 d，每3 d更换新 鲜分化培养液。以正常人羊膜上皮细胞作为对照组。 Real-time PCR：待细胞于平面培养至对数生长期， 按照试剂盒说明书提取RNA，并进行反转录合成cDNA和 实时荧光定量PCR。反转录条件为：37 15 min，85 15 s。实时荧光定量PCR条件为：预变性95 30 s，PCR 反应95 5 s，60 34 s，扩增45个循环。心肌 标志物为Nkx2.5及Gata4，以-actin 作为管家基因( 表1)。 主要观察指标：体外培养过程中造血细胞抗原 CD34、 CD45以及白细胞抗原 HLA-DR、人羊膜上皮细胞 干性标志物SSEA-4变化情况，诱导后细胞心肌标志物 Nkx2.5、 Gata4表达情况。 统 计 学 分 析 ： 利 用 OriginPro 7.5进 行 数 据 统 计 ， 使 用 one-way方 差 分 析 ， 当 P 0.05时 认 为 差 异 有 显 著 性 意 义 。 2 结果 Results 2.1 原代人羊膜上皮细胞的生长以及表型分析 原代人 羊膜上皮细胞呈现鹅卵石样上皮细胞形态，细胞之间排列 紧密，核位于细胞中央，清晰可见(图1) 。 流 式 细 胞 仪 分 析 显 示 ， 不 同 样 本 来 源 的 原 代 人 羊 膜 上 皮 细 胞 的 造 血 细 胞 抗 原 CD34、 CD45以 及 白 细 胞 抗 原 HLA- DR表 达 均 低 于 1%， 为 阴 性 ； 而 人 羊 膜 上 皮 细 胞 干 性 标 志 物 SSEA-4的 表 达 在 26.7%-97%， 最 高 和 最 低 表 达 之 间 相 差 约 4倍 (图 1B)， 这 说 明 尽 管 分 离 方 法 相 同 ， 来 源 于 不 同 个 体 的 原 代 人 羊 膜 上 皮 细 胞 的 SSEA-4表 达 仍 存 在 很 大 个 体 差 异 。 2.2 体外培养后人羊膜上皮细胞的生长和表型变化 流 式细胞仪分析显示，与原代人羊膜上皮细胞相比传代后人 羊膜上皮细胞(第 2 代，P2) 的 CD34、CD45 及 HLA-DR 的表达水平无变化(图 2A)，而干细胞标志物 SSEA-4 的 表达则由(46.829.8)%下降到(27.921.6)%，且样本之间 仍存在较大个体差异(图 2B)。另外，第 2 代人羊膜上皮 细胞在培养第 9 天达到平台期，细胞扩增了约 9 倍，提示 这一代数的人羊膜上皮细胞具有较好的增殖能力(图 2B)。 由 于 原 代 人 羊 膜 上 皮 细 胞 的 SSEA-4表 达 存 在 很 大 差 异 ， 为 了 解 体 外 培 养 后 SSEA-4的 表 达 和 原 代 细 胞 SSEA-4表 达 之 间 的 关 联 性 ， 接 下 来 作 者 选 取 了 SSEA-4分 别 高 (97%， 标 记 为 high)、 中 (51.6%， 标 记 为 medium)、 低 (26.7%， 标 记 为 low)表 达 的 3个 原 代 人 羊 膜 上 皮 细 胞 样 本 进 行 体 外 培 养 ， 观 察 培 养 后 各 个 样 本 人 羊 膜 上 皮 细 胞 形 态 和 表 型 的 变 化 。 实 验 结 果 显 示 ， 不 同 样 本 之 间 以 及 相 同 样 本 培 养 前 后 细 胞 形 态 无 明 显 差 别 (图 3)， 在 传 代 过 程 中 大 部 分 细 胞 均 保 持 了 上 皮 细 胞 形 态 ， 同 时 也 具 有 少 量 间 质 形 态 的 细 胞 。 细 胞 表 型 分 析 则 显 示 ， 培 养 后 3个 样 本 的 SSEA-4表 达 均 出 现 了 明 显 降 低 ， 分 别 下 降 了 88.3%(高 )、 56.2%(中 )及 8.6%(低 )。 由 此 可 见 ， 原 代 SSEA-4表 达 较 高 的 样 本 在 培 养 后 下 降 得 最 快 ， 而 表 达 较 低 的 样 本 培 养 后 下 降 得 最 慢 ， 此 结 果 提 示 原 代 SSEA-4的 表 达 高 低 与 传 代 后 人 羊 膜 上 皮 细 胞 干 性 标 志 物 SSEA-4表 达 水 平 无 关 。 人羊膜上皮细胞培养、分化及检测实验的主要试剂及仪器： 试剂及仪器 来源 商业化培养液 协和干细胞基因工程有限 公司大连分公司 心肌分化的 RPMI 1640 培养基、胎牛血清 Hyclone 公司 抗坏血酸磷酸钠 Sigma-Aldrich 公司 CCK-8 试剂 日本同仁公司 0.25%胰蛋白酶(含 0.02% EDTA) Gibco 公司 mouse anti-human HLA- DR、 CD34、CD45 、mouse IgG-FITC、 IgG- PE 以及 SSEA-4 (PE) BD Pharmingen公司 TRIzol、PrimeScript TM RT、2X SYBR Premix Ex TaqTM II TAKARA 公司 相差显微镜(Eclipse TE2000-U) Nikon 公司 酶标仪 Labsystems Dragon 公司 流式细胞仪(Well Scan MK3) BD FASCalibur Real-time PCR 仪(Stratagenes Mx3000 P Real-Time Cycler) Agilent Technology 公司 表 1 体外培养的人羊膜上皮细胞表型及分化能力所用引物序列 Table 1 Primer sequence of differentiation capacity of human amniotic epithelial cells cultured in vitro Target Primer sequence (5-3) Genbankacc No. Nkx2.5 5-CCC CTG GAT TTT GCA TTC AC-3 5-CGT GCG CAA GAA CAA ACG-3 NM_004387 Gata4 5-GTT TTT TCC CCT TTG ATT TTT GAT C-3 5-AAC GAC GGC AAC AAC GAT AAT-3 NM_002052 -actin 5-TGG CAC CCA GCA CAA TGA A-3 5-CTA AGT CATA GTC CGC CTA GAA GCA- 3 NM_001101 连建春，等 . 体外培养人羊膜上皮细胞的表型及分化能力 P.O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org214 www.CRTER.org 图 1 原代人羊膜上皮细胞的形态和表型分析 Figure 1 Morphology and phenotype analysis of primarily cultured human amniotic epithelial cells 图注：图中 A 为原代人羊膜上皮细胞的形态(标尺 100 m)；B 为原代人羊膜上皮细胞的细胞表型分析。相差显微镜观察显示，原代人羊 膜上皮细胞呈现上皮细胞形态；流式细胞仪分析则显示，CD34、CD45 以及 HLA-DR 均低于 1%，呈阴性，而原代人羊膜上皮细胞干性标志物 SSEA-4 的表达水平在 26.7%-97%，这说明不同胎儿样本来源的人羊膜上皮细胞的 SSEA-4 表达水平具有很大的个体差异。 A 阳性细胞比例(%) B 阳性细胞比例(%) SSEA- 阳性细胞比例(%) A A1 A2 A3 培养时间(d) 图 2 体外培养后人羊膜上皮细胞的表型变化及增殖曲线 Figure 2 Phenotype changes and proliferation curve of human amniotic epithelial cells after culture in vitro 图注： (1) 图中 A1 为原代(P0)以及体外培养后 (P2)人羊膜上皮细胞的 CD34、CD45 及 HLA-DR 表达；A2 为原代(P0) 以及体外培养后(P2)人羊膜上 皮细胞的 SSEA-4 表达；A3 为第 2 代人羊膜上皮细胞 (P2)的细胞增殖曲线； A4 为原代人羊膜上皮细胞 SSEA-4 高、中、低表达样本体外培养 后 SSEA-4 表达的变化。 (2) 图中 B1，B4 为高表达样本，B2，B5 为中表达样本，B3 ，B6 为低表达样本，不同样本之间以及相同样本培养前后并无明显细胞形态差别， 大部分细胞均保持了上皮细胞形态，同时也具有少量间质形态的细胞；B1，B2，B3 为第 1 代细胞，B4，B5，B6 为第 2 代细胞。 (3) 如图 A1 所示，与原代细胞 (P0)相比，体外培养后(P2) 人羊膜上皮细胞的 CD34、CD45 及 HLA-DR 表达水平无明显变化；如图 A2 所示， 与原代细胞(P0)相比，体外培养后(P2)人羊膜上皮细胞的 SSEA-4 的表达水平显著降低；如图 A3 所示，第 2 代人羊膜上皮细胞在培养第 9 天 达到平台期，细胞扩增了约 9 倍，增殖能力良好。 (4) 如图 A4 所示，与原代细胞(P0)相比，体外培养后人羊膜上皮细胞的 SSEA-4 表达水平均明显降低，分别下降了 88.3%(高)、56.2%(中)及 8.6%(低)。可见，原代 SSEA-4 表达最高样本在培养后下降得最快，而表达最低的样本培养后下降得最慢，结果提示，原代细胞 SSEA-4 的表 达水平高低与培养后人羊膜上皮细胞的 SSEA-4 表达水平无关。 SSEA-4 阳性细胞比例(%) 高 中 低 B1 1 B2 B3 B4 B5 B6 A4 CD34 CD45 HLA-DR SSEA-4 100 90 80 70 60 50 40 2 1 0 样本中 SSEA-4 表达 100 80 60 40 20 0 P0 P2 P0 P2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 80 60 40 20 0 2.0 1.5 1.0 0.5 0 CD34 CD45 HLA-DR P0 P2 连建春，等 . 体外培养人羊膜上皮细胞的表型及分化能力 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 215 www.CRTER.org 以 上 结 果 提 示 ， 目 前 的 培 养 条 件 无 法 维 持 人 羊 膜 上 皮 细 胞 干 细 胞 标 志 物 SSEA-4的 稳 定 表 达 。 此 外 ， 在 实 验 中 还 发 现 随 着 传 代 次 数 的 增 加 ， 某 些 样 本 来 源 的 人 羊 膜 上 皮 细 胞 形 态 发 生 了 明 显 改 变 ， 即 逐 渐 失 去 上 皮 细 胞 形 态 ，大量细胞变得狭长，出现了间质细胞形态(图 4)。细胞表型分析则显示，在人羊膜上皮细胞干性标志物 SSEA-4表达下降的同时，间质细胞标志物CD73、CD90 以及CD105 的表达则显著升高，超过 90%。 该结果提示，在目前的培养条件下，体外培养可能会 使得某些样本来源的人羊膜上皮细胞出现上皮-间质转化 (Epithelial-mesenchymal transition, EMT)的现象，这与 已报道的研究结果是符合的 24。 2.3 体 外 培 养 后 人 羊 膜 上 皮 细 胞 心 肌 分 化 的 潜 能 为 阐 明 人 羊 膜 上 皮 细 胞 的 SSEA-4表 达 水 平 与 分 化 能 力 的 关 联 性 ， 图 3 原代 SSEA-4 高、中、低表达样本心肌诱导后细胞形态(标尺 100 m) Figure 3 Morphology of cells derived from primarily cultured human amniotic epithelial cells with different SSEA-4 expression (high, moderate, and low) after cardiac differentiation (scale bar=100 m) 图注：图中 A，B，C 为高表达样本，D，E，F 为中表达样本，G ，H ，I 为低表达样本；A，D，G 为第 3 天高、中、低表达样本， B，E，H 为第 7 天高、中、低表达样本，C ，F，I 为第 14 天高、中、低表达样本。 选取 SSEA-4 分别高(97%，标记为 high)、中(51.6%， 标记为 medium)、低 (26.7%，标记为 low)表达的 3 个原代 HAEC 样本进行向心肌细胞的诱导分化，随着诱导时间的延长， 3 个样本的细胞形 态出现了显著不同。 A B C D E F G H I A B 图 4 出 现 上 皮 -间 质 转 化 现 象 样 本 的 人 羊 膜 上 皮 细 胞 形 态 (标 尺 100 m) Figure 4 Morphology of human amniotic epithelial cells with epithelial-mesenchymal transition (scale bar=100 m) 图 注 ： 图中 A 为原代细胞形态， B 为第 3 代细胞的形态。原 代 人 羊 膜 上 皮 细 胞 呈 现 鹅 卵 石 样 上 皮 细 胞 形 态 ； 而 第 3 代 细 胞 形 态 则 发 生 了 明 显 改 变 ， 大 量 细 胞 变 得 狭 长 ， 出 现 了 间 质 细 胞 的 形 态 。 连建春，等 . 体外培养人羊膜上皮细胞的表型及分化能力 P.O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org216 www.CRTER.org 实 验 考 察 了 上 述 SSEA-4表 达 水 平 不 同 的 3个 人 羊 膜 上 皮 细 胞 标 本 的 心 肌 分 化 能 力 。 结 果 显 示 ， 随 着 诱 导 时 间 的 延 长 ， 3个 样 本 的 细 胞 形 态 出 现 了 显 著 不 同 (图 5)。 Real-time PCR 检 测 结 果 显 示 ， 诱 导 后 SSEA-4中 表 达 样 本 心 肌 标 志 基 因 Nkx 2.5和 GATA4明 显 上 调 ； 高 表 达 样 本 仅 出 现 了 GATA4 的 升 高 ， Nkx2.5未 表 达 ； 低 表 达 样 本 并 未 出 现 心 肌 标 志 物 表 达 (图 5)。 以 上 结 果 提 示 ， 人 羊 膜 上 皮 细 胞 的 心 肌 分 化 能 力 存 在 个 体 差 异 ， 而 此 差 异 与 原 代 人 羊 膜 上 皮 细 胞 的 SSEA-4 表 达 水 平 无 关 。 3 讨论 Discussion 目 前 SSEA-4被 认 为 是 人 羊 膜 上 皮 细 胞 主 要 的 干 性 标 志 物 之 一 ， 其 表 达 越 高 代 表 人 羊 膜 上 皮 细 胞 的 干 性 越 强 11, 25-26。 此 次 实 验 首 先 发 现 ， 在 相 同 分 离 条 件 下 ， 不 同 胎 儿 样 本 来 源 的 原 代 人 羊 膜 上 皮 细 胞 的 SSEA-4蛋 白 表 达 水 平 存 在 很 大 的 差 异 ， 阳 性 细 胞 比 例 在 26.7%-97.0%， 最 高 和 最 低 表 达 之 间 相 差 约 4倍 ， 这 说 明 不 同 样 本 之 间 原 代 细 胞 SSEA-4表 达 存 在 很 大 的 个 体 差 异 ， 提 示 需 要 建 立 更 准 确 的 临 床 样 本 筛 选 指 标 来 稳 定 获 得 SSEA-4高 表 达 的 样 本 ， 以 更 好 地 进 行 人 羊 膜 上 皮 细 胞 的 质 量 监 控 。 已 有 的 研 究 表 明 ， 孕 龄 对 人 羊 膜 上 皮 细 胞 干 性 标 记 物 表 达 有 重 要 影 响 ， 与 晚 期 妊 娠 相 比 ， 来 自 中 期 妊 娠 的 羊 膜 上 皮 细 胞 高 表 达 Nanog、 Sox- 2， Tra-1-60 和 Tra-1-8027。 除 此 之 外 与 胎 儿 发 育 相 关 的 指 标 ， 如 双 顶 径 、 体 质 量 等 也 与 SSEA-4的 表 达 相 关 ， 但 是 对 于 以 上 结 论 还 需 要 大 量 样 本 的 统 计 和 验 证 。 通 过 探 索 临 床 各 类 指 标 与 人 羊 膜 上 皮 细 胞 干 性 标 志 物 表 达 等 生 物 学 特 性 之 间 的 关 联 ， 将 有 助 于 建 立 完 善 的 人 羊 膜 上 皮 细 胞 样 本 筛 选 指 标 ， 便 于 为 人 羊 膜 上 皮 细 胞 样 本 的 质 量 监 控 与 合 理 使 用 提 供 帮 助 。 另 外 ， 虽 然 本 实 验 使 用 的 商 业 化 培 养 液 中 添 加 了 多 种 利 于 人 羊 膜 上 皮 细 胞 生 长 的 因 子 ， 但 仍 无 法 维 持 SSEA-4的 稳 定 表 达 。 其 他 实 验 也 表 明 ， 人 羊 膜 上 皮 细 胞 干 性 标 记 物 的 种 类 及 水 平 受 到 了 培 养 方 法 的 影 响 28-30， 并 且 难 以 稳 定 维 持 18, 31。 因 此 可 知 ， 目 前 的 培 养 条 件 还 不 足 以 维 持 人 羊 膜 上 皮 细 胞 干 性 标 志 物 的 高 表 达 。 那 么 ， 同 样 具 有 SSEA-4等 表 达 的 胚 胎 干 细 胞 、 多 能 诱 导 干 细 胞 等 的 体 外 培 养 方 法 可 能 会 给 人 羊 膜 上 皮 细 胞 的 体 外 培 养 提 供 一 些 启 发 ， 如 与 某 些 特 殊 基 质 细 胞 进 行 共 培 养 ， 或 使 用 条 件 培 养 液 及 添 加 细 胞 外 基 质 等 ， 这 些 问 题 还 需 要 在 今 后 的 工 作 中 进 一 步 探 讨 。 此 外 ， 这 次 实 验 还 发 现 ， 不 同 样 本 来 源 人 羊 膜 上 皮 细 胞 的 心 肌 分 化 能 力 也 存 在 很 大 个 体 差 异 ， 且 与 原 代 细 胞 的 SSEA-4表 达 水 平 无 关 ， 类 似 结 果 在 向 其 他 组 织 分 化 的 研 究 中 也 有 报 道 32。 因 此 ， 想 要 找 到 影 响 体 外 培 养 后 人 羊 膜 上 皮 细 胞 定 向 分 化 的 关 键 因 素 ， 还 需 要 明 确 特 异 性 高 的 人 羊 膜 上 皮 细 胞 样 本 筛 选 指 标 及 优 化 维 持 干 性 的 培 养 条 件 。 总 之 ， 本 研 究 表 明 人 羊 膜 上 皮 细 胞 的 表 型 及 分 化 潜 能 存 在 较 大 的 个 体 差 异 ， 而 体 外 培 养 过 程 又 对 其 生 物 学 特 性 产 生 了 显 著 的 影 响 。 建 立 临 床 样 本 筛 选 指 标 ， 获 得 维 持 人 羊 膜 上 皮 细 胞 干 性 标 志 物 高 表 达 的 培 养 条 件 是 人 羊 膜 上 皮 细 胞 临 床 应 用 所 需 要 解 决 的 关 键 问 题 。 作者贡献 ：衷心感谢中科院大连化学物理研究所生物医用材 料工程组各位老师、同学 给予的技术 指导及帮助。 作者贡献 ：通讯作者和第一作者(刘洋) 负责实验设计，第一、 原 代 SSEA-4 高 、 中 、 低 表 达 样 本 诱 导 后 心 肌 标 志 物 Nkx2.5 的 表 达 原 代 SSEA-4 高 、 中 、 低 表 达 样 本 诱 导 后 心 肌 标 志 物 GATA4 的 表 达 。 高 中 低 A B 图 5 原代 SSEA-4 高、中、低表达样本诱导后心肌标志物表达 Figure 5 Cardiac gene marker expression of cells derived from primarily cultured human amniotic epithelial cells with different SSEA-4 expression (high, moderate, and low) after cardiac differentiation 图注： (1) Real-time PCR 检测结果显示，心肌诱导后 SSEA-4 中(medium) 表达样本中心肌标志基因 Nkx2.5 和 GATA4 明显上调了；高表达样本仅出 现了 GATA4 的升高， Nkx2.5 未表达；低表达样本并未出现心肌标志物表达。 (2) 结果提示，原代 SSEA-4 表达水平的高低与培养后 HAEC 心肌分化潜能无关，原代 SSEA-4 高表达的样本，培养后其心肌分化潜能不是最 高；同时，也发现培养后 SSEA-4 的表达高低与心肌分化潜能表达也无关，培养后 SSEA-4 表达居中的样本，诱导后并未出现心肌标志物。 样本中 SSEA-4 表达 高 中 低 样本中 SSEA-4 表达 Nkx2.5 基因表达 14 12 10 8 6 4 2 0 6 5 4 3 2 1 0 GATA4 基因表达 对照组 诱导组 连建春，等 . 体外培养人羊膜上皮细胞的表型及分化能力 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 217 www.CRTER.org 二、三、四、五和八作者负责实验实施，实验评估成文为两位共同 第一作者，通讯作者 对文章负责。 利益冲突 ：文章及内容不涉及相关利益冲突。 伦理要求 ：人羊膜组织样本来自大连市妇产医院。本研究获 得了大连市妇产医院伦理委员会的批准，所有样本均有产妇签署 的知情同意书。 学 术 术 语 ： SSEA-4-目