乙肝(hbv)的发展和研究近况

前 言 乙型肝炎病毒(HBV)感染仍是威胁着人民健康的全球性问题。目前,全世界 受 HBV 感染者接近 20 亿,其中有超过 3 亿的慢性感染者。在亚太地区,慢性 HBV 感染率超过 10%,其中 25%40%患者会因合并或不合并肝细胞癌的肝硬化而死亡。 世界卫生组织已将 HBV 感染列为全球十大死亡原因之一。 乙型病毒性肝炎（hepatitis B, HB）是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）引起的。HBV 的感染不仅可以导致急、慢性病毒性肝炎和重性肝炎，而且 还与肝硬化（liver cirrhosis, LC）和肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的发生、发展密切相关。20的慢性乙肝患者将发展成为肝硬化，HBV 慢 性感染的人罹患 HCC 的危险性是正常人的 100 倍。HBV 感染呈世界性分布，其 中西欧、北美、澳大利亚为低流行区，乙性肝炎病毒表面抗原（hepatitis B surface antigen, HBsAg）携带率在 2以下；东欧、日本、南美、北美和地 中海国家为中流行区；中国、东南亚与南非为高流行区（HBsAg 携带率 10左 右） 。全世界共有约 3.5 亿人为 HBsAg 慢性携带者，其中 3/4 在亚洲。HBV 感染 导致全球每年 50120 万人死亡，其中死于 HCC 的约占 32 万。我国是 HBV 感染 的高发区，约 60的人群感染过 HBV，10的人群为携带者，多达 1.2 亿。现 有乙型肝炎患者约为 1200 万，年发病率为 158/10 万。随着 HBV 疫苗在 1982 年 的问世，HBV 感染率大大降低，抗病毒药物的出现也使乙型肝炎的治疗取得了 一定的进展。 第 1 章 课题研究背景与价值 第 11 节 选题的意义与价值 世界卫生组织估计全世界大约有 20 亿乙型肝炎病毒（ hepatitis B virus,HBV）感染者，其中 3.54 亿为 HBV 慢性感染者，每年由于急慢性 HBV 感染而死亡的人数达到 100 万，并呈上升趋势。乙型肝炎的现状仍然不容 乐观，现有乙型肝炎患者及带毒者数量庞大，面临发展为肝硬化和肝癌的危险。 而我国是乙肝大国，占据其中的 1/3，有 1.2 亿 HBV 携带者。从数据而知，乙 肝病毒感染已成为危害人类健康的重要疾病，因此对 HBV 感染者有效的抗 HBV 治疗在全世界特别是在我国显得尤为迫切。 不幸的是，到目前为止，还没有针对 HBV 的特效药物。因此，乙型肝炎的 治疗至少在今后 50 年内仍然是一个严重的问题，寻找更有效的治疗途径是重大 的研究课题。 1.1.1 理论意义与价值 （1）就哲学的高度而言，乙型肝炎的现状不容乐观，现有乙型肝炎患者及 带毒者数量庞大。HBV 对他们的生活产生了极大的影响，携带者或患者的饮食 起居，婚姻，学业全都受到很大影响。为了全世界人民免受其影响，乙肝病毒 的防治研究刻不容缓。 （2）就专业或学科角度而言，全世界大约有 20 亿乙型肝炎病毒 （hepatitis B virus,HBV）感染者，其中 3.54 亿为 HBV 慢性感染者，每年由 于急慢性 HBV 感染而死亡的人数达到 100 万，并呈上升趋势。患者及携带者 都面临发展为肝硬化和肝癌的危险。 （3）就我国 HBV 的现状角度而言，我国是乙肝大国，占据其中的 1/3， 有 1.2 亿 HBV 携带者。从数据而知，乙肝病毒感染已成为危害人类健康的重要 疾病，因此对 HBV 感染者有效的抗 HBV 治疗在全世界特别是在我国显得尤为 迫切。 1.1.2 实践意义与价值 通过对 HBV 的传播途径和发病机理的研究，对乙肝病毒患者或携带者早发 现早治疗，抑制病毒复制，促进病毒清除。减轻肝脏炎症及坏死，促进肝细胞 燕京理工学院 2015 届微生物学大作业 3 修复。阻止或延缓发展为肝硬化。减少 HBV 相关性肝癌的发生率，改善患者的 生活质量，延长生存期，缓解、减轻临床症状。避免病情发展成重症肝炎或慢 性肝炎。 第 1.2 节 研究目的与研究方法 HBV 是嗜肝 DNA 病毒科的原型病毒，在宿主细胞核内形成共价闭合环状 DNA(cccDNA)进行复制。药物治疗慢性乙型肝炎多采用抗病毒、免疫调节、改善 肝功能和抗肝纤维化等方法，而抗病毒治疗是其中最主要和关键的治疗措施。 已发现的抗 HBV 药物种类十分有限，而且 HBV 倾向于不断的突变从而能够逃避 特异性的抗 HBV 化合物的抑制作用，因此寻找有效的抗 HBV 药物的研究任重道 远。 第 2 章 HBV 的基本知识 2.1 节 HBV 的概述 乙型肝炎病毒（hepatitis B virus）,是指引起人类急、慢性肝炎的DNA病 毒，也称丹氏颗粒，简称HBV。根据目前所知，HBV就只对人和猩猩有易感性。 是引起中国及东南亚一带病毒性肝炎的主要病原之一 1P322-331，有半数以上HBV 感染的患者将会发展为慢性肝炎(Chronic Hepatitis, CH)、肝硬化(Liver Cirrhosis, LC)，甚至肝细胞性1fl癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC )，常 被形象的称之为“慢性肝病三步曲” 2.2节 HBV的生物学特性 2.2.1 HBV 的生物学分类 1986年国际病毒革命委员会正式将人类HBV划归为一个新的病毒科嗜肝 DNA病毒科（Hepadnaviridae）的成员。该科病毒成员除了人HBV外还有：（1） 东方土拨鼠肝炎病毒（GHV） ，1978年在美国新泽西州和马里兰州等地的野生土 拨鼠发现该病毒。东方土拨鼠肝炎和肝癌的发病率较高；（2）地松鼠肝炎病毒 （GHV） ，是1980年在美国南加州的地松鼠中发现的；（3）鸭乙型肝炎病毒 （DHBV） ，1981年在我国江苏省启东县肝癌高发区分离自易发生肝癌的麻鸭，后 来在北京能够鸭和美国商品鸭中也发现此病毒。 2.2.2 HBV的形态与结构 HBV 在动物病毒中是不寻常的，是由于在被浸染的细胞中能产生多类型的 与病毒相关的颗粒，电镜下观察 HBV 的提纯制品，证明有三种类型颗粒 2P489- 494。 (1)小球型颗粒 平均直径为 22nm，由空心病毒包膜组成，是 HBV 多余的衣 壳蛋白，没有病毒核酸。无感染性，但刺激机体产生相应的抗体，具有中和病 毒的作用，制备乙肝疫苗即由此种颗粒组成。 (2)管型颗粒 由小球型颗粒连接而成，其长短不一。小球型颗粒和管型颗 粒的产生是由于病毒颗粒包膜产量过剩。小球型颗粒和管型颗粒与 Dane 颗粒的 燕京理工学院 2015 届微生物学大作业 5 比例依不同的病程差异较大，一般撒 Dane 颗粒的 10 4 108 倍，在患者血液 中的含量可高达 10 13个/ml. (3)Dane颗粒 为完整的具有感染性的病毒颗粒，直径为42nm，由包膜和核 衣壳组成 3P121-150。核衣壳直径为27nm，含有HBcAg，单一分子的部分双链DNA 以及依赖DNA的DNA聚合酶。核衣壳很重要的一个功能是作为病毒基因组的保护 性容器。另一独特的特征是P蛋白与长DNA链共价结合。在患者血液中的Dane颗 粒含量为10 4 10 6个/ml. 图 2.1 电子显微镜下可以观察到乙肝病毒 3 种不同的形态： 大球形颗粒，小球形颗粒和管形颗粒 图2.2 肝病毒（HBV）结构示意图（立体图） 图2.3 肝病毒（HBV）结构示意图（平面图） 2.2.3 理化特性及抵抗力 在氧化铯平衡梯度离心中，HBV 颗粒（42nm）的浮力为 1.22g/cm3.表面抗 原颗粒为 1.22g/cm3，病毒外膜成分含有来自宿主细胞的脂类，约占外膜干重的 30%。 HBV 对理化因素有较强的抵抗力。病毒在 30 32 可存活至少 6 个月， 在 -20 可存活 15 年。病毒浓度高时，60 加热 10h,或 98 加热 1min, 以及乙醚或 pH2。4 处理均不能有效灭活乙肝病毒，能够灭活 HBV 的常用方法和 条件包括 121高压灭菌 20min, 160 干烤 1h，100直接煮沸 2min,以及 0.5%过氧化酸，3%漂白粉溶液，5%次氯酸钠和环氧乙烷等的直接处理。HBV 的 感染性并非与其抗原性和免疫原性相一致，在一些能够灭活 HBV 感染性的条件 下，其抗原性和免疫原性-仍可较好保留。 2.2.4 HBV 的基因组和蛋白组成 HBV 基因组结构特殊，成不完全闭合的双链形式，负（-）链为全长基因， 约含 3200 个核苷酸，而正（+）链是负链长度的 2080%，病毒颗粒内含有 DNA 聚合酶 4P280-283。在所有已知可感染人体而且具有独立复制能力的双链 DNA 病 毒中，HBV 基因组是最小但又是最高效的。 它具有以下 4 个鲜明的特点： （1）不完全双链环状结构； （2）利用重叠的开放读码框（open reading frame ORF）编码多个蛋白质； 燕京理工学院 2015 届微生物学大作业 7 （3）所有调控序列均位于蛋白质编码区内； 图2.4 HBV基因组基本结构 HBV 含有 4 个 ORF，即 S 区（包括 preS1、preS2 及 S） 、C 区（包括 preC 和 C） 、P 区和 X 区，ORF 之间互相重叠。HBV 有 4 种转录子，共用一个 PolyA 加 尾信号，长度分别为 3.5kb、2.4kb、2.1kb 和 0.7kb。4 种 mRNA 合成 7 种病毒 蛋白，即外膜蛋白（大、中、主蛋白） 、核壳蛋白（前 C 和 C 蛋白） 、X 蛋白和 P 蛋白 5P157-169。 外膜蛋白由 S 基因区编码，包括 3 种外膜成分：主蛋白（small protein ,S protein, 即 HBsAg） 、中蛋白（middle protein ,M protein, 即 preS2+HBsAg）和大蛋白（large protein ,L protein, 即 preS1+preS2+HBsAg）,主蛋白在 3 种成分中含量最高。主蛋白和中蛋白由 2.1kbmRNA 翻译而来，而大蛋白则是 2.4kbmRNA 的产物。HBV 的外膜蛋白构成病 毒的外壳包裹颗粒，使病毒能够附着和侵入新的细胞。大蛋白在病毒与细胞受 体的结合、病毒颗粒的包装和自细胞向外分泌的过程中发挥重要作用。此外， 外膜蛋白还含有引起宿主免疫反应的抗原表位，能够刺激机体产生保护性免疫 应答。 核壳蛋白由 HBV 基因组的 C 区编码，存在两种形式：核心抗原（HBcAg）和 e 抗原(HBeAg). HBcAg 分子量 21KD，是病毒核壳的组成成分，在病毒复制过程 中负责对前基因组 RNA 包装，这是基因组复制的必备步骤。HBcAg 有较强的免 疫原性，几乎所有的 HBV 感染者均产生针对 HBcAg 的抗体。HBeAg 是分泌性蛋 白，先由 preC+C 区编码带有信号肽的 24KD 的前体蛋白，前体蛋白进入高尔基 体被蛋白酶切割后形成 16KD 成熟分子进入病人的血液中，HBeAg 可诱导机体产 生相应的抗体，其功能尚不清楚。HBcAg 和 HBeAg 均是 3.5kbmRNA 的翻译产物。 P 蛋白即聚合酶（polymerasa, Pol）由 P 基因区编码， 是一个含 816 个 氨基酸的大蛋白，也是 3.5kbmRNA 的翻译产物 6P299-305。目前已经发现 P 蛋白 具有 4 个功能性结构域，P 蛋白参与病毒基因组复制的全过程，每一个结构域 在基因组复制过程中都发挥不同的作用。HBV 前基因组 RNA 反转录过程中的几 个关键步骤，包括 RNA 的包装、DNA 合成所需的引物、以 RNA 和 DNA 为模板合 成 DNA 以及将 RNA-DNA 杂交体中的 RNA 消化等，均涉及 P 蛋白的功能。由于 P 蛋白的重要性，使其成为抗病毒药物的主要靶点。 X蛋白由X基因区编码，其转录子为0.7kbmRNA。X蛋白具有多种功能。它可 反式激活HBV本身的、其它病毒或细胞的调节序列，还可以激活蛋白激酶C，从 而影响细胞信号转导。病毒在体内复制和传播也需要X蛋白的参与。 2.2.5 HBV 的复制 在 HBV 的复制过程中，最突出的特点是，作为 DNA 病毒，HBV 不以 DNA 为 模板进行复制，而是将 DNA 转录 RNA 中间体（RNA intermediate）或称前基因 组 RNA，再逆转录成 DNA 进行复制，与逆转录病毒的复制过程类似。HBV 的复制 过程有以下几个环节： （1）侵入：病毒颗粒的外膜蛋白和宿主细胞膜上的受体（至今不清楚）结 合，脱去外壳 核心颗粒进入细胞质，进而脱去核壳，病毒 DNA 及聚合酶进入细胞核； （2）修复：HBV 聚合酶修复不完整的正链，使其与负链完全互补，形成共 价闭合环状 DNA（covalently closed circular DNA, ccc DNA）,即超螺旋结 构，是病毒复制的重要标志； （3）转录：宿主 RNA 聚合酶以 ccc DNA 为模板，转录出长短不一的 mRAN,这些 mRNA 分子从细胞核转移到细胞质； （4）复制： mRNA 分子在细胞质内被翻译成外膜、核心、X 和聚合酶等多 种蛋白。3.5kbmRNA 被成为前基因组 RNA（pregenomic RNA,pRNA）,含有病毒编 燕京理工学院 2015 届微生物学大作业 9 码的全部遗传信息，既是蛋白质翻译的模板，也是 HBV 基因组复制时反转录的 模板。在细胞质内，核心蛋白包裹 pRNA 和聚合酶形成新生的核心颗粒，病毒复 制即在其中进行：先由病毒自身的聚合酶以 pRNA 为模板，逆转录出负链 DNA，pRNA 被降解：再以负链为模板，合成正链 DNA，形成部分双链的环状 DNA，即成熟的病毒基因组； （5）循环：一小部分含有病毒基因组的核心颗粒重新进入细胞核，以维持 核内一定量的 ccc DNA； （6）释放：大多数新形成的核心颗粒出芽到细胞质，装配好病毒的外壳， 形成成熟的病毒颗粒释放到细胞外。 图2.5 HBV的复制过程 第 3 章 HBV 的显微镜观察 3.1 节 电子显微镜技术 电子显微镜技术主要包括常规电镜法(electronmicros-copy,EM)和免疫电 镜法(immune electron microscopy,IEM)。 （1）常规电镜法 1970 年英国学者 Dane 等在电镜下发现了完整 HBV 颗粒即 Danes 颗粒2, R De Vos 等随后用电子显微镜观察 18 例 HBsAg 阳性的慢性肝炎患者的肝组织, 发现了直径约 25 nm 的核心抗原(HBcAg)颗粒 7P300-305。常规电镜法的优点是标 本用量小、制样速度快、观察比较直观,不过因其观察灵敏度较低而要求病毒在 标本中大量存在,所以本检测技术在观察 HBV 方面的应用受到限制。 （2）免疫电镜法 免疫电镜技术是免疫化学技术与电镜技术结合的产物,是在超微结构水平研 究和观察抗原、抗体结合定位的一种方法学。Takashi 等 8P141-148对 96 例 HBsAg 阳性患者的肝组织进行免疫电镜观察,发现在肝细胞胞浆和胞核中存在 HBcAg 和 HBeAg。胡莲美等在 HBV 转基因小鼠血清中发现直径约 22nm 的球形 HBsAg,以及少量直径约 42nm 的 Danes 颗粒。免疫电镜法较常规电镜法的敏感性 高,从而可增加 HBV 的检出率,但该检测技术的样本制备过程较复杂,对操作者的 技能要求较高。 3.2 节 HBV 的显微镜观察试验 乙型肝炎病毒（HBV）是 1970 年由 Dane 氏发现，经电镜检查显示 HBV 有 3 种基本形态，其中最多的是 22nm 的小球形及直径相同而长度超过 200nm 的长条 丝状体，最少的是直径 42nm 的圆球体，即具有感染性的 Dane 颗粒。Dane 颗粒 内有 1 个 27nm 直径的核心，含双链 DNA，外壳为无感染性的 HBsAg 蛋白质，其 某些特性提示它可能是 HBV 的完整形式。Dane 颗粒的发现为研究 HBcAg 提供了 基础。本实验将含有 Dane 颗粒的 HBsAg 阳性血浆，根据其沉降速度和浮密度的 燕京理工学院 2015 届微生物学大作业 11 不同，通过等密度区带离心和速率区带离心进行颗粒的分离和提纯，经多次试 验能够获得较为纯净及完整的 Dane 颗粒。 3.2.1 材料和仪器 （1）材料 血浆：HBV 的 HBsAg 阳性血浆由疫苗室提供。 试剂：溴化钾、蔗糖、氯化钙和磷钨酸均为分析纯。硫酸铵为分析纯。 （2）仪器和设备 CP56G 超速离心机 核算蛋白检测仪 超滤器 电镜 3.2.2 实验方法 脱纤维蛋白：将 HBsAg 阳性血浆化冻导入大桶，测 RPHA 滴度后在搅拌下 加入一定浓度 CaCl2溶液，置水温箱中每 30 分钟搅动一次，温度达到 37 摄氏 度后静止一段时间，取出后以 4000r/min9P876-881上机离心脱纤维蛋白，合并上 清液废弃沉淀。 硫酸铵盐析：在搅拌下将硫酸铵粉末加入上清充分溶解，使其达到饱和 度后放室温过夜。4000r/min 离心，合并沉淀物用溴化钾盐析溶解粗提后再离 心，合并沉淀物用 NaCl 洗涤后，再进行离心，废弃最后沉淀。 区带离心提纯：配置不同比重溴化钾、不同浓度蔗糖梯度液及顶液后， 进行区带离心。 用电镜进行观察。 第 4 章 HBV 的生长繁殖和分类鉴定 4.1 节 HBV 的生长繁殖 4.1.1 繁殖第一步：黏附 这一步是乙肝病毒是侵入肝细胞的关键。乙肝病毒侵入人体后需要依靠其 外膜(表面抗原)黏附在肝细胞膜上，只有黏附成功才能侵入人体。当黏附成功 后，乙肝病毒的外膜将会脱离，乙肝病毒则钻进肝细胞内寄生。表面抗原脱离 后进入血液循环，我们就可以通过乙肝两对半检查来发现它。 4.1.2 繁殖第二步：脱壳 乙肝病毒核心部分来到肝细胞内，在肝细胞浆中还要脱掉它的“核壳” 10 P762-785(核心抗原及 E 抗原)，这样，就暴露了它最核心部分，即乙肝病毒核酸 (乙肝病毒 DNA)，它包涵着乙肝病毒的全部基因，是它主宰着乙肝病毒的繁殖。 4.1.3 繁殖第三步：入核 乙肝病毒 DNA 从肝细胞浆内进入肝细胞核，在这里它要进一步发育完善， 形成乙肝病毒的共价闭合环状脱氧核糖核酸(乙肝病毒-cccDNA)。它深藏在肝细 胞核内，而肝细胞核外面有一层坚韧的核膜，仅凭目前药物的力量难以通过这 坚韧的核膜，因而也无法杀灭进入肝细胞的病毒。由于 cccdna 掌控着乙肝病毒 所有的遗传信息，指令着乙肝病毒的繁殖，因此如果不能破核治疗，现有的药 物想彻底消灭体内的乙肝病毒几乎是不可能的。的病毒。由于 cccdna 掌控着乙 肝病毒所有的遗传信息，指令着乙肝病毒的繁殖，因此如果不能破核治疗，现 有的药物想彻底消灭体内的乙肝病毒几乎是不可能的。 4.1.4 繁殖第四步：转录 乙肝病毒在这一阶段会以 cccdna 为“模子” ，在人体酶类的帮助下，将所 有信息转录到信息核糖核酸(mRNA)上。 4.1.5 繁殖第五步：翻译 mRNA 通过翻译过程，可将乙肝病毒的各种蛋白制造出来，如外膜蛋白、核 壳蛋白、乙肝病毒-DNA 多聚酶等。至此乙肝病毒的零件都有了，漂浮游离着备 用，只等乙肝病毒最核心的部分制造出来。 燕京理工学院 2015 届微生物学大作业 13 4.1.6 繁殖第六步：逆转录 将乙肝病毒的遗传信息从 DNA 转录到 RNA 是“顺转录” ，从 RNA 再转录到 DNA 就叫做“逆转录” 。乙肝病毒的 mRNA 上的遗传信息最后就转录成了乙肝病 毒的 DNA，这是，乙肝病毒的最核心部分，即乙肝病毒-DNA 也制造完成。这个 “逆转录”的过程是导致乙肝病毒变异的根本原因。 4.1.7 繁殖第七步：组装 把所有的已经生产完成的零件组装在通过“逆转录”生成的乙肝病毒 HNA 上，乙肝病毒也就完成了新一代的繁殖。新生成的乙肝病毒又开始入侵其他健 康的肝细胞或者释放到血液当中去。 乙肝病毒繁殖是很快，甚至不到 48 小时就能繁殖出一代。 4.2 节 HBV 的分类鉴定 4.2.1 HBV的分类 乙型肝炎病毒(HBV) 属嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae)，基因组长约 3.2kb，为部分双链环状DNA。HBV的抵抗力较强，但6510 h、煮沸10 min或高 压蒸气均可灭活HBV 11P69-73。环氧乙烷、戊二醛、过氧乙酸和碘伏对HBV也有较 好的灭活效果。 HBV侵入肝细胞后，部分双链环状HBV DNA在细胞核内以负链DNA为模板延长 正链，修补正链中的裂隙区，形成共价闭合环状DNA (cccDNA)；然后以cccDNA 为模板，转录成几种不同长度的mRNA，分别作为前基因组RNA和编码HBV的各种 抗原。cccDNA半衰期较长，很难从体内彻底清除。 HBV 已发现有 AI 9 个基因型，在我国以 CB 型和型为主。HBV 基因型和疾 病进展和干扰素 治疗效果有关。与 C 基因型相比，B 基因型感染者较早出现 HBeAg 血清学转换，较少进展为慢性肝炎、肝硬化和原发性肝细胞癌；HBeAg 阳 性患者对干扰素 治疗的应答率高于 C 基因型。A 基因型患者对干扰素 治 疗的应答率高于 C 和 D 基因型。 4.2.2 HBV 的鉴定 （1）乙肝“两对半”的意义 图 4.1 乙肝“两对半”的意义 （2）ALT 的意义 谷丙转氨酶（ALT）主要存在于肝细胞中。当肝脏发生炎症、坏死时，ALT 就会从肝细胞内大量释放入血，导致血清中 ALT 升高 12P70-73，因此 ALT 升高是 判断肝细胞损害的一个敏感指标。 但是除了病毒性肝炎外，其它类型的肝炎或肝脏疾病，ALT 也会升高。 （3） 常规检测的 HBV 血清标志物的基本解释 表 4.1 常规检测的 HBV 血清标志物的基本解释 HBsAg HBV 感染，但未必是急性肝炎或者慢性病变活动的病原 抗 HBs 感染后免疫；对疫苗的免疫应答；或 HBIG 的被动免疫 HBeAg 反映 HBV 复制，有病毒血症，血液高传染性 抗 HBe ALT 持续正常者表示 HBV 低复制或不复制， HBsAg(+)血液低传染 性。 ALT 波动者表示病毒变异。 抗 HBc 低滴度表示过去感染；高滴度表示现行感染 IgM 抗 HBc 高滴度表示急性或近期感染；活动性病变可出现低滴度 （4）HBV-DNA 的意义 DNA 是基因，因此 HBV-DNA 是 HBV 的遗传物质，当 HBV 侵入肝细胞后，就 会以 HBV-DNA 为模板，合成新的 HBV 颗粒并释放入血，故 HBV-DNA 是病毒复制 的一个重要指标。 燕京理工学院 2015 届微生物学大作业 15 第 5 章 乙型肝炎医学常识 第 5.1 节 乙型肝炎的危害与传播 5.1.1 慢性乙肝的全球性负担 （1）3.5 亿慢性乙肝病人 （2）我国 HBsAg 阳性率为 9.09%13P367-369 （3）每年 1 百万人死于肝衰或肝癌 （4）全球第 9 位死亡原因 图 5.1 全世界乙肝病毒感染的流行概况 5.1.2 我国 HBV 感染流行现状 （1）我国是 HBV 感染的高流行区。 （2）我国 HBV 感染率概况为： -抗 HBc 及或抗 HBs 阳性：60 -非感染人群：26 -慢性乙型肝炎：2 -表面抗原阳性的慢性无症状 HBV 携带者：10 -表面抗原阴性的慢性无症状 HBV 携带者：2 5.1.3 乙肝病毒感染的危害 （1）慢性乙型肝炎是世界上最常见的传染病之一。 （2）乙肝病毒的传染性比引起艾滋病的 HIV 病毒强 100 倍 14P11-13 （3）乙肝病毒的持续感染造成乙肝慢性化，后者继续发展可导致肝硬化、 肝细胞癌。 （4）乙型肝炎是世界上第九大致死原因。 5.1.4 乙肝传染源 （1）各种急性、慢性乙肝病人以及 HBsAg 携带者均为传染源。 （2）HBV 主要存在于病人的血液。在体液和分泌物（如唾液、精液、阴道 分泌物等）中含量很微，故仍以经血传播为主。 （3）HBsAg 携带者常无症状，不易被发现，是最重要的传染源。 （4）传染性的强弱与病毒的复制状态有关。乙肝病毒复制指标 HBeAg、HBV-DAN 阳性者传染性强 15P713-736。 5.1.5 乙肝传播途径 （1）母婴传播 母婴传播约占 50以上，其中宫内感染约占 4.54%，其余为分娩时的感染； 分娩时母亲的血液、阴道分泌物通过胎儿 的破损皮肤、粘膜而传染；胎盘剥离 时微量血液漏至胎循环中；产前或产程中胎儿吸入母亲的血液、羊水、 阴道分 泌物而感染。 （2）父婴传播 父婴传播发生率不清，但比例不高，有报告父亲 HBsAg 阳性时，其子女的 HBsAg 阳性率为 17.99%。 （3）医源性传播 因消毒不严格的医疗器械而传播，如多次使用的注射器、针头、针灸针、 各种介入性穿刺、内镜检查、牙科治疗、手术等。该方式以农村地区较高，医 务人员(意外暴露)较高。 （4）性传播 夫妻一方 HBsAg 阳性时，经过平均 27 个月，其 HBV 指标的阳转率高达 53。但 HBsAg 的阳性率仅 14 16P21-23，提示夫妻间 HBV 传播率虽高，但转慢 率不高，多数自然痊愈。 （5）血液传播 最常见的血液传播：输血、共用针筒；血液传播的其他途径：皮肤上的伤 燕京理工学院 2015 届微生物学大作业 17 口，口腔内的溃疡，理发、扎耳钉。对献血员筛查 HBsAg 后显著降低。 （6）澄清对传播途径认识的误区 HBV 并不经口途径传播。依据是：HBV 不随粪便排出，除非有消化道出血者。 试验证明：污染 HBsAg 阳性血液的粪便保存数日后 HBsAg 即转阴。未见有经水、 食物污染而引起的乙肝暴发流行。蚊、臭虫等吸血昆虫在 HBV 传播中的作用尚 无确实的证据 17P2159-2173。 5.1.6 乙肝患病高危人群 母亲是 HBV 感染者的婴儿；乙肝患者的家庭成员；吸毒者；监狱犯人；性 传播疾病病人；血液透析病人；医护人员。 5.2 节 乙肝的病因与临床 5.2.1 乙肝的病因 （1）病原学 乙型肝炎病毒(HBV) 属嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae)，基因组长约 3.2kb，为部分双链环状DNA 18P661-662。HBV的抵抗力较强，但6510 h、煮沸10 min或高压蒸气均可灭活HBV。环氧乙烷、戊二醛、过氧乙酸和碘伏对HBV也有较 好的灭活效果。 HBV侵入肝细胞后，部分双链环状HBV DNA在细胞核内以负链DNA为模板延长 正链，修补正链中的裂隙区，形成共价闭合环状DNA (cccDNA)；然后以cccDNA 为模板，转录成几种不同长度的mRNA，分别作为前基因组RNA和编码HBV的各种 抗原。cccDNA半寿(衰) 期较长，很难从体内彻底清除。 HBV 已发现有 AI 9 个基因型 19P51-68，在我国以 CB 型和型为主。HBV 基因 型和疾病进展和干扰素 治疗效果有关。与 C 基因型相比，B 基因型感染者较 早出现 HBeAg 血清学转换，较少进展为慢性肝炎、肝硬化和原发性肝细胞癌； HBeAg 阳性患者对干扰素 治疗的应答率高于 C 基因型（41%：15%） 。A 基因型 患者对干扰素 治疗的应答率高于 C 和 D 基因型（45%：34%） 。 （2）流行病学 HBV感染呈世界性流行，但不同地区HBV感染的流行强度差异很大。据世界 卫生组织报道，全球约20亿人曾感染过HBV，其中3.5亿人为慢性HBV感染者，每 年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌(HCC)。 2006年全国乙型肝炎流行病学调查表明，我国1-59岁一般人群HBsAg携带率 为7.18%， 5岁以下儿童的HBsAg为1% 20P374-381。据此推算，我国现有的慢性HBV 感染者约9300万人，其中慢性乙型肝炎患者约2000万例。 HBV是血源传播疾病，主要经血（不安全注射等） 、母婴及性接触传播。由 于对献血员实施严格的HBsAg筛查，经输血或血液制品引起的HBV感染已较少发 生；经破损的皮肤粘膜传播主要是由于使用未经严格消毒的医疗器械、侵入性 诊疗操作和手术，不安全注射特别是注射毒品等；其他如修足、纹身、扎耳环 孔、医务人员工作中的意外暴露、共用剃须刀和牙刷等也可传播。母婴传播主 要发生在围生产期，多为在分娩时接触HBV阳性母亲的血液和体液传播，随着乙 型肝炎疫苗联合乙型肝炎免疫球蛋白的应用，母婴传播已大为减少。与HBV阳性 者发生无防护的性接触，特别是有多个性伴侣者，其感染HBV的危险性增高。 HBV不经呼吸道和消化道传播，因此日常学习、工作或生活接触，如同一办 公室工作(包括共用计算机等办公用品)、握手、拥抱、同住一宿舍、同一餐厅 用餐和共用厕所等无血液暴露的接触，一般不会传染HBV。流行病学和实验研究 亦未发现HBV能否经吸血昆虫(蚊、臭虫等) 传播。 （3）自然史 感染时的年龄是影响慢性化的最主要因素。在围生(产) 期和婴幼儿时期感 染HBV者中，分别有90%和25%30%将发展成慢性感染，而5岁以后感染者仅有 510发展为慢性感染 。婴幼儿期HBV感染的自然史一般可人为地划分为4个 期，即免疫耐受期、免疫清除期、非活动或低（非）复制期和再活动期。免疫 耐受期：其特点是血清HBsAg和HBeAg阳性 21P1833-1841， HBV DNA载量高( 常 106 IU/mL，相当于107拷贝 /mL)，但血清丙氨酸氨基转移酶(ALT) 水平正常， 肝组织学无明显异常并可维持数年甚至数十年，或轻度炎症、坏死、也无或缓 慢肝纤维化的进展。免疫清除期：表现为血清HBV DNA滴度 2000 IU/mL（相当 于104拷贝/mL） ，伴有ALT/天门冬氨酸氨基转移酶(AST) 持续或间歇升高，肝组 织学中度或严重炎症、坏死、肝纤维化可快速进展，部分患者可发展为肝硬化 和肝衰竭。非活动或低(非) 复制期：表现为HBeAg阴性、抗-HBe阳性，HBV DNA 持续低于2000 IU/mL（相当于104拷贝/mL）或检测不出(PCR法)、ALT水平正常， 肝组织学无炎症或仅有轻度炎症；这是HBV感染获得免疫控制的结果，发生肝硬 化和HCC的风险大大减少，在一些持续HBV DNA转阴数年的患者，自发性HBsAg血 清学转换率为13%年 22P3935-3941。再活动期（Immunu reactive phase）： 部分处于非活动期患者可能出现1次或数次的肝炎发作，多数表现为HBeAg阴性、 燕京理工学院 2015 届微生物学大作业 19 抗-HBe阳性（部分是由于前C区与或BCP变异所导致HBeAg表达水平低下或不表 达） ，但仍有HBV DNA活动性复制、ALT持续或反复异常，成为HBeAg阴性CHB，这 些患者可进展为肝纤维化、肝硬化、失代偿肝硬化和HCC5；也有部分患者可出 現自发性HBsAg消失（伴或不伴抗-HBs）和HBV DNA降低或检测不到，因而预后 常良好。少数非活动期的患者可逆转为HBeAg阳性状态（特别是在接受化疗或免 疫抑制剂治疗时） 。 并非所有感染HBV者均经过以上四个期。新生儿时期感染HBV，仅少数（约 510%）可自发清除HBV；多数有较长的免疫耐受期，随后转为免疫清除期。 但青少年和成年时期感染HBV，多无免疫耐受期，而直接进入免疫清除期，他们 中的大部分可自发清除HBV（约9095） ，少数（约510）发展为HBeAg 阳性慢性乙型肝炎。 自发性HBeAg血清学转换主要出现在免疫清除期，年发生率约为215%， 其中年龄小于40岁、ALT升高以及感染HBV基因A和B型者发生率较高。HBeAg血清 学转换后每年大约有0.5%1.0%发生HBsAg清除。 慢性HBV感染者的肝硬化发生率与感染状态有关。免疫耐受期患者只有很轻 或无肝纤维化进展，而免疫清除期是肝硬化的高发时期 23P2285-2292。肝硬化的 累积发生率与持续高病毒载量呈正相关，HBV DNA是独立于HBeAg和ALT以外预测 肝硬化发生的危险因素。发生肝硬化的高危因素还包括嗜酒、合并HCV、HDV或 HIV感染等。 非肝硬化的患者较少发生原发性肝细胞肝癌（HCC） 。肝硬化患者中 HCC 年 发生率为 3%6%。HBeAg 阳性和/或 HBV DNA 2,000 IU/mL（相当于 104 拷贝 /mL）是肝硬化和 HCC 发生的显著危险因素。大样本研究显示 24P243-257，年龄大、 男性、ALT 水平高也是肝硬化和 HCC 发生的危险因素。HCC 家族史是相关因素。 在同样的遗传背景下，HBV 病毒载量更为重要。 图 5.2 HBV 感染的自然史和治疗时机 5.2.2 乙肝的临床诊断 既往有乙型肝炎病史或HBsAg阳性超过6个月，现HBsAg和HBV DNA仍为阳性 者，可诊断为慢性HBV感染。根据HBV感染者的血清学、病毒学、生物化学试验 及其他临床和辅助检查结果，可将慢性HBV感染分为： （1）慢性乙型肝炎 HBeAg阳性慢性乙型肝炎 血清HBsAg、HBeAg阳性、抗-HBe阴性，HBV DNA 阳性，ALT持续或反复升高，或肝组织学检查有肝炎病变。 HBeAg阴性慢性乙型肝炎 血清HBsAg阳性， HBeAg持续阴性，抗-HBe阳性 或阴性， HBV DNA阳性，ALT持续或反复异常，或肝组织学检查有肝炎病变。根 据生物化学试验及其他临床和辅助检查结果，上述两型慢性乙型肝炎也可进一 步分为轻度、中度和重度。 （2）乙型肝炎肝硬化 乙型肝炎肝硬化是慢性乙型肝炎发展的结果，其病理学定义为弥漫性纤维 化伴有假小叶形成。 代偿期肝硬化 一般属Child-Pugh A级。影像学、生化学或血液学检查有 肝细胞合成功能障碍或门静脉高压症（如脾功能亢进及食管胃底静脉曲张）证 据，或组织学符合肝硬化诊断，但无食管胃底静脉曲张破裂出血、腹水或肝性 脑病等严重并发症。 失代偿期肝硬化 一般属Child-Pugh B、C级。患者已发生食管胃底静脉 曲张破裂出血、肝性脑病、腹水等严重并发症。亦可将代偿期和失代偿期肝硬 化再分为活动期或静止期。 （3）携带者 慢性HBV携带者多为处于免疫耐受期的HBsAg、HBeAg和HBV DNA阳性者，1 年内连续随访3次以上均显示血清ALT和AST在正常范围，肝组织学检查无明显异 常。 非活动性HBsAg携带者血清HBsAg阳性、HBeAg阴性、抗-HBe阳性或阴性， HBV DNA低于最低检测限，1年内连续随访3次以上， ALT均在正常范围。肝组织 学检查显示：Knodell 肝炎活动指数（HAI）51 mol/L。 5.4.2 核苷（酸）类似物治疗 （1）目前已应用于临床的抗HBV核苷（酸）类似物药物有5种，我国已上市 4种。 拉米夫定（lamivudine， LAM） 国内外随机对照临床试验结果表明，每日1次口服100 mg拉米夫定可明显抑 制HBV DNA水平， HBeAg血清学转换率随治疗时间延长而提高，治疗1、2、3、4 和5年时分别为16%、17%、23%、28和35；治疗前ALT水平较高者，其HBeAg 血清学转换率较高。随机双盲临床试验表明，慢性乙型肝炎伴明显肝纤维化和 代偿期肝硬化患者经拉米夫定治疗3年可延缓疾病进展、降低肝功能失代偿及肝 癌的发生率。失代偿期肝硬化患者经拉米夫定治疗后也能改善肝功能，延长生 存期。国外研究结果显示，拉米夫定治疗儿童慢性乙型肝炎的疗效与成人相似， 安全性良好。我国临床研究也显示相似的临床疗效和安全性。 拉米夫定不良反应发生率低，安全性类似安慰剂。随治疗时间延长，病毒 耐药突变的发生率增高(第1、2、3、4年分别为14%、38%、49%和66%)。 阿德福韦酯(adefovir dipivoxil, ADV) 国内外随机双盲临床试验表明，HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者口服阿德福韦 酯可明显抑制HBV DNA复制、促进ALT复常、改善干组织炎症坏死和纤维化。对 HBeAg阳性患者治疗1、2、3年时，HBV DNA40岁，特别是男性或有HCC家族史者，即使ALT正常或轻度 升高，也强烈建议做肝组织学检查，确定其是否抗病毒治疗。 非活动性HBsAg携带者一般不需抗病毒治疗，但应每6个月进行一次生化、 HBV DNA、AFP及肝脏超声显像检查。 (2) HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者 普通IFN- 35 MU (可根据患者的耐受情况适当调整剂量)，每周3次或 隔日1次，皮下注射，一般疗程为6个月。如有应答，为提高疗效亦可延长疗程 至1年或更长。应注意剂量及疗程的个体化；如治疗6个月仍无应答，可改用或 联合其他抗病毒药物。 聚乙二醇IFN- 2a 180 g，每周1次，皮下注射，疗程1年。具体剂量 和疗程可根据患者应答及耐受性等因素进行调整。 聚乙二醇IFN- 2b 1.01.5g/kg，每周1次，皮下注射，疗程1年。具 燕京理工学院 2015 届微生物学大作业 29 体剂量和疗程可根据患者耐受性等因素进行调整。 拉米夫定100 mg，每日1次口服。治疗至少1年时，如HBV DNA检测不到 (PCR法) 或低于检测下限、ALT复常、HBeAg转阴但未出现抗-HBe，建议继续用 药直至HBeAg血清学转换，再经至少连续2次监测(每次间隔6个月以上)， 仍保 持不变者可考虑停药，但延长疗程可减少复发。 阿德福韦酯 10 mg，每日1次口服。疗程可参照拉米夫定。 恩替卡韦0.5 mg，每日1次口服。疗程可参照拉米夫定。 替比夫定600 mg，每日1次口服。疗程可参照拉米夫定。 (3) HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者 此类患者复发率高，疗程宜长。最好选用干扰素类或耐药发生率低的核苷 (酸) 类似物治疗。 普通IFN- 剂量用法同前，疗程至少1年。 聚乙二醇IFN-2a 180g，剂量用法同前，疗程至少1年。具体剂量和 疗程可根据患者耐受性等因素进行调整。 拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦和替比夫定剂量用法同前，但疗程更 长：治疗至少1年时，当连续监测至少3次(每次间隔6个月以上) HBV DNA均检测 不到(PCR法) 或低于检测下限、且ALT正常时可考虑停药，由于停药后复发率较 高，可以延长疗程。 (4) 代偿期乙型肝炎肝硬化患者 治疗目标是延缓和降低肝功能失代偿和HCC的发生。因需要较长期治疗，最 好选用耐药发生率低的核苷(酸) 类似物治疗，其停药标准尚不清楚。 干扰素因其有导致肝功能失代偿等并发症的可能，应十分慎重。如认为有 必要，宜从小剂量开始，根据患者的耐受情况逐渐增加到预定的治疗剂量。 (五) 失代偿期乙型肝炎肝硬化患者 对于失代偿期肝硬化患者，只要能检出HBV DNA，不论ALT或AST是否升高， 建议在知情同意的基础上，及时应用核苷（酸）类似物抗病毒治疗，以改善肝 功能并延缓或减少肝移植的需求。因需要长期治疗，应好选用耐药发生率低的 核苷(酸) 类似物治疗，不能随意停药，一旦发生耐药变异，应及时加用其他已 批准的能治疗耐药变异的核苷(酸) 类似物。 干扰素治疗可导致肝衰竭，因此，对失代偿期肝硬化患者属禁忌证。 第 6 章 乙肝的药物研发 第 6.1 节 抗乙型肝炎药物作用机理 目前抗乙肝病毒药物主要包括两大类，即免疫调节剂(包括干扰素和胸腺素 等)和病毒抑制剂(包括阿行德福韦及拉米夫定等)。下面就主要应用的药物做一 下介绍 6.1.1 免疫调节剂 （1） 干扰素 干扰素(-IFN)1992 年，美国 FDA 批准 干扰素 (IFN)应用于治疗慢 性乙型肝炎病人 29P265-272，干扰素的作用机制主要包括直接抗病毒作用和免疫 调节作用。IFN 的抗病毒作用是通过激活细胞内 2-5寡核昔酸合成酶催化寡 核昔酸合成，进而激活内源性核酸内切酶，导致病毒 mRNA 裂解，阻止 HBV 复制。其免疫调节作用表现为促进肝细胞表达人类白细胞抗原，从而促进受 HBV 感染的肝细胞被 CD8+细胞毒淋巴细胞清除。最近发现 IFN 还能抑制 HBVDNA 增强子 1 活性，从而抑制其复制 4。 （2） 胸腺肽(T 1) 胸腺肽(T1)抑制 HBV 复制及 ALT 复常的疗效与 -IFN 相似，但起效速 度慢于 -IFN，而有较强的后继作用。 （3） 猪苓多糖 猪苓多糖对肝炎患者有减轻肝损伤、促进肝细胞再生及促使机体提前产生 抗 HBs 抗体和增加滴度的作用，对细胞免疫也有增强作用，猪苓多糖合并乙肝 疫苗可提高其疗效。该疗法优点是无明显副作用，价格低廉。 第 6.2 节 抗乙型肝炎几大类药物 6.2.1 核苷类药物 核昔类似物的发展已经引发了一场治疗慢性乙型肝炎的革命。拉米夫定 燕京理工学院 2015 届微生物学大作业 31 (lamivudine)和更新的核昔类似物阿德福韦(adefovir)、恩替卡韦(entecavir)、替 比夫定(telbivudine)通过抑制 HBVDNA 多聚酶而阻断 HBV 复制，它们的抗病 毒活性不依赖宿主对 HBV 的免疫反应。新一代核昔类似物具有口服生物利用 度高，患者耐受性好的特点，因而可以长期使用。近年来，核昔类抗病毒药物 的研究相当活跃，研究报道大量涌现，相继推出了一系列高效低毒的药物。 核昔类 HBV 抑制剂可选择性阻断 HBVRNA 依赖的逆转录或 DNA 依赖的 DNA 聚合，从而发挥抑制 HBV 复制的作用。这类化合物 5位首先在宿主细胞内 磷酸化，形成 5-三磷酸化物，进而在 HBV DNA 聚合酶的作用下与病毒 DNA 链末端相互作用，阻断 HBV DNA 的复制。其选择性在很大程度上依赖于其磷 酸化代谢产物与 HBV DNA 聚合酶的亲和力。 其中以拉米夫定为常用抗乙肝药物，拉米夫定(3TC )全称是 -L-2，3-双 脱氧-3- 硫胞嘧啶核昔，是双脱氧胞苷的结构类似物，也是第一个被批准用于治 疗慢性 HBV 感染的核昔类药物。3TC 不仅以其代谢中产生的 dCTP 与 DNA POl 所催化的天然底物 dCTP 竞争结合于 DNA，而且核苷糖环上 3-OH 端已被硫原 子(S)所取代，而不能与其后的 dNTP 形成 5-3磷酸二脂链，故导致 DNA 链合 成终止，因此 3TC 抑制 HBV DNA 作用强而迅速。 6.2.2 焦磷酸类似物 膦甲酸钠为焦磷酸盐类似物，是 HBV DNA 聚合酶抑制剂，可用于耐药株 感染的控制，有良好的抑制 HBV 的作用，但抑制 HBV 作用短暂，宜作为抗病 毒序贯疗法的首程用药或联合用药的选择之一。 6.2.3 中草药 很多中草药提取物对乙肝有一定的作用，如联苯双酯、水飞蓟宾、齐墩果 酸和甘草酸二胺等，具有保护肝细胞，改善肝功能和降酶作用，但对 HBV 的 抑制作用较弱，因此疗效不明显。最近几年从苦豆子中提