vegf在人大肠癌组织的意义

血管内皮生长因子及其受体在人大肠癌组织中的分布、 定量和意义 陈 治 1 王晓莉 2 张 莉 2 黄宗海 1 潘玉先 1 曹长安 1 1 中国人民解放军第一军医大学珠江医院普通外科 广东省广州市 510282 2 华西医科大学附二院妇产科 四川省成都市 项目负责人 陈治 中国人民解放军第一军医大学珠江医院普通外科 广东省广州市 510282 收稿日期 2000-01-14 接收日期 2000-01-20 Subject headings intestinal neoplasms; endothelium; vascular; immunohistochemistry; vascular endothelial growth factor; vascular endothelial growth factor receptor; toumor vascular targeting therapy 主题词 肠肿瘤；内皮；血管；免疫组织化学反应；血管内皮生长因子；血管内皮生长因子受体；肿瘤血 管靶向治疗 陈治,王晓莉, 张莉, 黄宗海,潘玉先,曹长安. 血管内皮生长因子及其受体在人大肠癌组织中的分布、定量和意 义. 世界华人消化杂志，2000；8(4)：472-473 肿瘤的生长和转移与肿瘤区的血管密切相关. 1971 年 Folkman 首先提出抑制肿瘤血管形成可作为肿瘤治 疗的一个途径，随后这种以肿瘤血管为靶的治疗策略肿瘤血管靶向治疗(toumor vascular targeting therapy)日益受到重视. 血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是最重要的血管形成 因子之一，VEGF 及其受体(VEGFR)是肿瘤血管靶向治疗的理想靶点. 以 VEGF 为靶点的治疗实验已有大量 报道 1-3 ，以 VEGFR 为靶点近期亦有较成功的尝试 4，5 ，本实验旨在观察和比较大肠癌组织中 VEGF 及其 受体 KDR 的表达差异，为确定以 VEGF 及 VEGFR 作为肿瘤血管靶向治疗的靶点何者为优提供依据. 1 材料和方法 1.1 材料 大肠癌组织标本 80 例来自珠江医院普通外科 1992/1998 年住院手术患者，年龄 38 岁78 岁 (平均 58.7 岁)，男 58 例，女 22 例，所有患者术前均未接受化疗、放疗或其他针对肿瘤的治疗 . 标本按组 织学 Broder 法分型分为四型：高分化腺癌、中分化腺癌、低分化腺癌和粘液腺癌. 正常大肠组织标本 10 例进行对照. 所有标本均用 100g/L 甲醛固定 24h ，常规石蜡包埋，制备 5m 厚的连续切片， 贴附于涂有多聚赖氨酸的载玻片上. 主要试剂：小鼠抗人 VEGF 单克隆抗体 (IgGl)购自美国 Neuwork 公司， 小鼠抗人 KDR 单克隆抗体 (IgGl)购自美国 Sigma 公司，DAB 显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公 司. Comment s1: 作用机理：旁分泌 （英语：paracrine）是指细胞分 泌物不进入血液循环，而是通过 扩散作用作用于邻近靶细胞，进 行细胞间信号传递的分泌方式， 这种信号传递方式可以控制靶细 胞的生长和功能。例如，肿瘤细 胞会产生某种激素或调节因子 （血管内皮生长因子） ，通过细胞 间隙对邻近的其他种类细胞起到 促进的作用。这种功能活动是通 过局部体液因素进行的，可以认 为是局部性体液调节。 1.2 方法 邻片免疫组织化学双标记法：免疫组化染色采用 SABC法，第一抗体为鼠抗人 VEGF单克隆 抗体和鼠抗人 KDR单克隆抗体(工作浓度均为 1100)，正常鼠 IgG作为阴性对照，PBS 替代第一抗体作 为空白对照，正常大肠组织切片作为正常对照. 于每个标本的连续切片中选取相邻切片，分别以鼠抗 VEGF抗体和鼠抗 KDR抗体按 SABC法进行邻片双标记研究，VEGF 阳性染色以见到定位于肿瘤细胞胞质 或胞膜的棕色染色为准，KDR 阳性染色以见到定位于血管内皮细胞膜的棕色染色为准. 图象分析法定量： 鉴于大肠癌组织学切片中细胞间的分界线往往不明确，采用 Macintosh 图象分析系统(Adob photoshop 5.0)按文献 6 提供的方法 (公式 11)计算待测切片上阳性反应程度的阳性单位(PU)，得到免疫组化显色反 应的量化结果. 统计学处理 PU值以 xs 表示，邻片间 VEGF与 KDR的表达量比较采用配对资料的 t 检验. 以 上统计分析均在 Spess 8.0统计分析软件中进行 . 2 结果 2.1 免疫组化染色结果 正常大肠组织及空白对照切片中均未见免疫反应阳性信号 . 在癌组织中，VEGF 阳性物质主要位于癌细胞的胞膜和(或) 胞质，血管内皮细胞上未见 VEGF染色；KDR 阳性物质主要位于癌 组织的血管内皮细胞上，且新生血管内皮细胞的着色明显强于较大血管内皮细胞. 部分无血管区域的癌细 胞上也有弱的 KDR染色. VEGF 和 KDR的染色程度与肿瘤区域及病理分型有关，癌组织边缘区细胞的染 色要强于中心区，按病理分型恶性程度高者较恶性程度低者染色程度为强，对比两张邻片，VEGF 的阳 性反应强度要明显强于 KDR. 2.2 图象分析法定量结果 80例大肠癌中，VEGF 的阳性反应定量结果为 19.29.5，KDR 的阳性反应定 量结果为 10.57.1，二者间存在显著性差异( P0.01). 3 讨论 实体瘤的生长和转移需要新生血管生成，肿瘤血管形成受肿瘤细胞分泌的血管形成因子调节. 目前，已经 发现的血管形成因子较多，VEGF 是其中最重要的，它即可直接作用于血管内皮细胞，刺激其有丝分裂的 发生，从而促进新生血管的生长，也可通过增加血管通透性，使包括许多基质形成重要因子的血浆蛋白外 渗，为血管内皮细胞的迁移及肿瘤细胞的转移提供基质. VEGF是通过作用于内皮细胞上的 VEGF受体来发 挥其生物学作用的 ，已发现的 VEGF受体有三种：FLK-1(KDR)，FLT-1 ，FLT-4 ，已知与内皮细胞的增殖 和血管生成有关的只有 FLK-1(KDR)7 . 目前关于 VEGF及其受体在肿瘤组织中的表达部位及作用方式认识不一. Wizigmann et al 8 认 为 VEGF主要表达于肿瘤细胞 . Brown et al 9 研究发现 VEGF不仅表达于肿瘤细胞，血管内皮细胞 也可表达，而 FLK-1(KDR)仅表达于肿瘤血管内皮细胞，在肿瘤上皮细胞中不表达. Boocock et al 10 则发现 FLK-1 (KDR)不仅可在肿瘤间质的血管内皮细胞中表达，而且在肿瘤上皮中亦有表达. 我们的研 究发现，VEGF 主要表达于大肠癌细胞中，在肿瘤血管内皮细胞中无表达；FLK-1(KDR)主要表达于肿瘤血 管内皮细胞，部分大肠癌细胞中亦有较弱表达，这表明 VEGF主要是通过旁分泌作用机制诱导肿瘤血管形 成，从而促进肿瘤细胞的生长，同时可能作为一种自分泌生长调节因子直接促进肿瘤细胞的生长. 本研究结果说明：作为一种可分泌的蛋白， VEGF主要分布于肿瘤细胞中，而 KDR主要位于血管内 皮细胞上，这样药物入血后可直接作用于 KDR，而作用于 VEGF则需穿透血管；虽然二者在恶性肿瘤中 都有表达，但 KDR相比 VEGF的表达量明显为低，由此推测，使用较小的药量作用于 KDR就可能达到较 好的治疗效果. 由此预测，在肿瘤血管的靶向治疗中，VEGF 受体作为靶点可能比以 VEGF更有效. 4 参考文献 1 王贵齐，王耐勤，刘彤，徐光炜，董志伟. 血管内皮生长因子抗体对实验性肿瘤的抑制作用. 中华肿瘤 杂志，1997；19：163-166 2 董凡，许新，景乃禾，金由辛. 反义寡核苷酸抑制肿瘤细胞表达 VEGF 的研究. 肿瘤，1997；17 ：63- 66 3 董凡，金由辛. VEGF 反义核酸抑制肿瘤血管形成的研究. 中华肿瘤杂志， 1997；19 ：264-266 4 Zhu ZP, Rockwell P, Lu D, Kotanides H, Pytowski B, Hicklin DJ, Bohlen P. Inhibition of vascular endothelial growth factor -induced receptor activation with anti-kinase insert domain-containing receptor single-chain antibodies from a phage display library. Cancer Res, 1998;58:3209-3214 5 李晓明，汤钊猷，陈方国. 突变型 flk-1 基因转染抑制肝癌在裸鼠体内血管形成，生长和转移. 中国 肿瘤生物治疗杂志， 1998；5 ：160-162 6 申洪，陆药丹. 免疫组织化学染色的定量方法研究. 生物医学工程学杂志，1993；10：281-284 7 Witte L, Hicklin DJ, Zhu ZP, Pytowski B, Kotanides H, Rockwell P, B hlen P. Monoclonal antibodies targeting the VEGF receptor-2 (Flk 1/KDR) as an anti-angiogenic therapeutic strategy. Cancer And Metastasis Reviews, 1998;17:155-161 8 Wizigmann-Voos S, Breier G, Risau W, Plate KH. Up-regulation of vascular endothelial growth factor and its receptors in von Hippel-Lindau disease-associated and sporadic hemangioblastomas. Cancer Res, 1995;55:1358-1364 9 Brown LF, Berse B, Jackman RW, Tognazzi K, Manseau EJ, Dvorak HF, Senger DR. Increased expression of vascular permeability factor and its receptors in kidney and bladder carcinomas. Am J Pathol, 1993;143:1255-1262 10 Bo