hif-1作为作用靶点的肿瘤临床治疗研究

【论文关键词】 HIF-1；肿瘤；调节机制；治疗靶点 【论文摘 要】 本文结合 HIF-1 的结构和功能特点，详细综述了 HIF-1 对肿瘤血管生 成的主要调节机制，对以 HIF-1 为作用靶点的肿瘤临床治疗前景作了简要展望。 现代研究认为，恶性肿瘤的显著特征是肿瘤细胞的大量增殖和转移。其中，细胞大量 增殖导致的组织缺氧是肿瘤的基本微环境，缺氧可以刺激肿瘤细胞一系列基因产物的表达 诱导微血管生成，新生微血管不仅为肿瘤细胞带来营养成分，带走代谢产物，同时肿瘤细 胞也可以通过新生的毛细血管发生转移。近年的研究表明1 ， 缺氧诱导因子- 1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）可在基因水平上直接调控血管内皮生长因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达，并促进肿瘤生长。本文就 HIF-1 与肿 瘤的相关性研究作一简要综述。 1 HIF-1 的结构和功能 HIF-1 最先由 Semenza 和 Wang 于 1992 年发现，将其作为被缺氧诱导的连接在 EPO 基因诱导元件上的一个核因子 2。HIF-1 是由 亚基和 亚基组成的异二聚体转录因 子，由 A、B、C、D 四条链组成。其中 A、B 链是 DNA 分子，均由 14 个碱基组成。C 链为 亚基，与已知的芳香烃受体核转位蛋白（ aryldrocarbon receptor nuclear translocator ，ARNT）相同，其开放阅读框有 2367bp 和 2322bp2 种，分别编码 789 和 774 个氨基酸， 分子量为 80kD。D 链是 亚单位，人类 HIF-1 基因定位于 14q21-24，含有 826 个氨 基酸，分子量为 120 kD，是 HIF-1 的调节和活性亚基3 。HIF-1 和 HIF-1 的共同特 点：N 端具有基本螺旋- 环- 螺旋（ basic helix-loop-helix，bHLH ）结构的碱性蛋白，其 后紧随 PAS（Per-ARNT-Sim）区域，bHLH 和 PAS 区域主要介导异源二聚体的形成，以 及负责与 DNA 的缺氧反应元件（ hypoxia response elements，HRE）结合4，另外在 C 端 具有一个或多个反式激活域（trans-activation domains，TAD） ，负责与转录起始复合物结合 参与转录活化5 。HIF-1 的 C-TAD 与 N-TAD 之间 576785 位氨基酸序列为抑制结构 域，能降低 TAD 的活性，在常氧细胞中该抑制明显。另外，HIF-1 还包含两个核定位 信号（nuclear localization signal，NLS）：N-端核定位信号和 C-端核定位信号，C-NLS 在 HIF-1 核定位方面发挥更为重要的作用。HIF-1 常氧状态下极不稳定，半衰期小于 510 分钟，Huang LE 等61998 年发现，在 HIF-1 401603 区域， 有一个氧依赖降 解区（ oxygen-dependent degradation domain，ODD） ，其中一部分与 N-TAD 重合，负责 HIF-1 的降解。当环境氧的浓度超过 5%时，通过激活泛素蛋白酶体路径，作用于 HIF- 1 的 ODD 区，使其迅速降解。如果截去 ODD 区，可以使 HIF-1 在有氧状态下保持 稳定，并且仍可与 ARNT 形成二聚体及与 DNA 结合，此时即使环境不缺氧，它也具有完 整的转录活性。HIF-1 羧基端含有 PEST样基序，因富含脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸和苏 氨酸，其主要作用是加速常氧下 ODD 介导的 HIF-1 蛋白经泛素蛋白酶复合体途径降 解。HIF-1 的两个亚单位中，HIF-l 与细胞的多种功能有关而不仅限于 O2 代谢，HIF- 1 则仅与 O2 代谢有关。HIF-1 在细胞中组成性表达，而 亚基是 HIF-1 的调节和 活性亚基。HIF-1 蛋白常氧状态下极不稳定，但能在缺氧条件下保持稳定，并且是组织 缺氧的内在标志7。 2 HIF-1 调节肿瘤血管生成的相关机制 大量的研究表明，在多数恶性肿瘤组织内，HIF-1 都有一定程度的表达，然而，HIF-1 在不同肿瘤中高表达的机制不尽相同，而这些不同的机制下诱导的 HIF-1 的表达参与了肿 瘤的不同的恶性生物学行为。Birnal 等8进一步研究发现 HIF-1 的表达亦与肿瘤细胞的 增殖、浸润及转移能力相关，其表达越高，预后越差。大量新生血管形成及糖酵解增强是 实质性恶性肿瘤的两个主要特征，正是这两个特征使得肿瘤细胞能够适应缺氧环境。HIF-1 下游基因既参与血管生成，又参与无氧糖酵解，因此，HIF-1 在瘤细胞适应缺氧环境过程 中起中心介导作用，是诱导肿瘤血管生成的核心分子9。 HIF-1 调节血管生成的主要机制 可分为 VEGF 依赖途径和 VEGF 非依赖途径两类。 2.1 VEGF 依赖途径 HIF-1 通过诱导 VEGF 表达，特异地结合位于血管内皮细胞上的特异受体 Flt-1 和 KDR，促进内皮细胞生长，增加血管通透性，进而促进血管生成。VEGF 是血管生长的主 要因子，各种类型细胞中 VEGF 的表达随氧气浓度的降低而升高，如低氧培养的细胞 VEGF mRNA 水平和蛋白明显升高，恢复正常氧张力时则回降；坏死区周围肿瘤细胞的 VEGF mRNA 呈高度表达，说明局部低氧是肿瘤微环境内 VEGF 基因表达的主要诱因。 Maxwell 等10 在小鼠皮下种植 HIF-1 突变的肝癌细胞，发现移植瘤生长缓慢，免疫组 化示微血管密度显著减少，采用原位杂交技术发现 VEGF mRNA 表达近缺失。Ravi 等11发 现经转染 HIF-1 表达载体的 HCT116 结肠癌细胞，VEGF 蛋白表达显著增加，异种移植 瘤生长速度加快，血管化作用增强。研究发现，HIF-1 通过增强 VEGF 的转录活性与增加 VEGFmRNA 稳定性两个方面调节 VEGF 的稳定表达12。进一步研究表明，HIF-1 对 VEGF 的调控首先在于其与 HRE 的结合，激活 C-TAD，使之与 p300/CBP 环腺苷酸反应 元件结合蛋白 CH1 的结合力增强，通过此核磷酸蛋白将转录信号传递给 VEGF 基因，促 进 VEGF 的转录及表达13。体外细胞培养表明，通过转基因手段强制表达 HIF-1 后，在 低氧和正常氧分压条件下 VEGF 的表达均明显增加。有研究表明，去除 VEGF 的增强子或 诱导 HIF-1 结合位点序列内出现点突变则 HIF-1 对 VEGF 调控作用就不复存在，此时 VEGF mRNA 水平显著降低，即使在低氧条件下，VEGF mRNA 也未被诱导表达14, 15。 另外，缺氧状态下 VEGF mRNA 5非转录区存在内部核糖体插入位点（internal ribosome entry site，IRES） ，能保护 VEGF mRNA 进行蛋白质翻译16。这些表明 HIF-1 在 VEGF mRNA 的稳定表达方面起到了一定作用。另外，HIF-1 可以上调 VEGF 受体 Flt-1 的转录， Flt-1 的大量表达，加强了 VEGF 的生物学效应17。最新研究还提示，VEGF mRNA 的 3非转录区富含腺核苷酸-鸟核苷酸（ AU） ，缺氧时高表达的 RNA 结合蛋白 HuR 与富含 AU 的元件具有特别亲和力，HuR 则可使 VEGF mRNA 在有氧状态下也不被降解，HuR 表达与 HIF-1 密切相关18。 2.2 VEGF 非依赖途径 VEGF 非依赖途径主要是 HIF-1 通过促进其他因子表达或癌基因发生作用19。体外 细胞实验证实，HIF-1 可诱导人内皮细胞环氧合酶-2 （COX-2）的表达，而 COX-2 及其合 成产物前列腺素等可通过除 VEGF 以外的碱性成纤维细胞生长因子、血小板源生长因子、 表皮生长因子及胰岛素样生长因子等多种途径调节血管生成。国内学者分别将合成的具有 HIF-1 特异结合位点的 DNA 片段红细胞生成素 3-增强子（ EPO 3-enhancer）及 HIF-1 结 合位点突变的 DNA 片段，经脂质体包裹转入鼠主动脉内皮细胞与肺微血管内皮细胞，应 用 RT-PCR 对 COX-2 的表达进行半定量观察。发现在缺氧时，主动脉和微血管内皮细胞 COX-2 的表达都有增加，但经转入 EPO 3DNA 片段的内皮细胞，缺氧对 COX-2 的诱导 作用被显著减弱，转入将 HIF-1 结合位点突变的 DNA 片段则无此抑制作用。据此推测缺 氧诱导 COX-2 表达时，HIF-1 在其信息传递中可能起着关键作用。氯化钻（CoCl2）是特 异性的 HIF-1 诱导剂，在其作用下体外培养的人脐静脉内皮细胞 COX-2 mRNA 水平显著 提高，提示 CoCl2 可使 COX-2 基因转录明显增强，而向细胞导人 EPO 3-增强子野生片段 可阻断 CoCl2 诱导的 COX-2 转录，若导入点突变片段则无阻断作用。进而推断 COX-2 基 因序列中可能存在类似的 HIF-1 结合序列，HIF-1 诱导 COX-2 基因表达增强可能主要通过 HIF-1 与该序列的结合实现，由于 EPO 3-增强子片段对 HIF-1 竞争性结合抑制，导致被转 入细胞对缺氧反应的减弱。Naomoto 等20的研究也证实了 HIF-l 可能通过 COX-2 途 径在多种肿瘤的血管生成中起重要作用。但是缺氧条件下，HIF-1 调节肿瘤血管生成还是 以 VEGF 依赖途径为主。 3 HIF-1 与肿瘤治疗 肿瘤组织内的缺氧环境可以诱导 HIF-1 的表达，继而诱导下游多种靶基因的转录和 表达增强，尤其 HIF-1 诱导 VEGF 表达途径，在促使肿瘤的微血管的生成，肿瘤细胞的生 长代谢以及恶性转化过程中起到了重要的枢纽作用。目前，HIF-1 在肿瘤治疗方面的研 究大致可分为药物治疗和基因治疗两类。接下来我们结合这两种研究思路，总结并展望一 下以 HIF-1 为靶点的肿瘤治疗前景。 3.1 药物治疗 目前，正在研究的抑制 HIF-1 活性药物大体可分为两类：阻断相关信号转导通路； 小分子 HIF-1 活性抑制剂。可溶性鸟苷酸环化酶抑制剂 YC-1 能够有效抑制 HIF-1 表 达，且能够抑制 VEGF 的表达，减弱血管化作用21。热休克蛋白 90 抑制剂格尔德霉素， 通过抑制热休克蛋白 90 与 HIF-1 结合而使 HIF-1 稳定性消失22。苯甲酸类似物是 一类新的 HIF-1 抑制剂，能够有效地抑制缺氧时人类肝癌 Hep3B 细胞中 HIF-1 蛋白集 聚和其靶基因的表达23。雷帕霉素可通过下调 HIF-1 和 VEGFmRNA 的水平而抑制肝 癌的生长和转移24。非甾体消炎药和缺氧性细胞毒素 TX-402，亦可通过阻断或抑制 HIF- 1 的表达来抑制血管生成。在脑胶质细胞瘤中， 一种新发现的小分子 HIF-1 抑制剂 103D5R25以及 ras 癌基因抑制剂26，可通过减少 HIF-1 蛋白合成而抑制其下游靶基 因的表达。最新研究表明，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂丁酸钠在低氧环境下，能够通过抑制 HIF-1 介导的血管生成抑制 HT1080 人纤维肉瘤细胞的生长27。 3.2 基因治疗 肿瘤的基因治疗的关键在于肿瘤特异性的载体的开发，通过其结合肿瘤特异性表位以 实现基因治疗。Ruan 把自杀基因 Bax 反义 RNA 导入 HRE 的下游，在缺氧状态下转染了 自杀基因质粒的细胞优先凋亡28。另外可以通过利用反义 RNA 来抑制 HIF-1 的活性， 利用 RNA 干扰配合放疗29。反义 HIF-1 可能通过阻断 HIF-1 和 survivin 的表达而 增强胰腺癌对化疗的敏感性30。酪蛋白激酶