02-最新分子生物学

最新分子生物学实验技术 梁国栋著 科学出版社出版 索书号：58.178/2 分类号：022692 内容介绍： 本书着重介绍国际上近年发展起来的分子生物学及生物技术方面的新技术、新方法， 突出一个“新”字。书中大部分章节是目前国际上的研究热点。如：DNA 与蛋白质相互关 系、抗体工程、噬体表面显示技术、蛋白质与蛋白质相互关系等。本书对一些有过介绍的， 如基因文库构建及筛选，聚合酶链反应(PCR)、DNA 测序、基因表达等一些基本实验方法 也做了叙述。使本书成为一本较为全面的介绍分子生物学最新实验方法的参考书。因此本 书即是一本实用性极强的介绍新技术、新方法的实验手册。也是一本统揽当今分子生物学 新理论、新进展的参考书。 本书可供分子生物学、生物化学、生物技术、医药卫生以及农、林、牧等方面有关的 科研、教学与技术人员参考之用。 本书目录： 序 前言 第 1 章 DNA 与蛋白质相互关系 1.1 细胞核蛋白质的提取 1.1.1 细胞核蛋白质的提取 1.1.2 细胞核提取物的快速制备法 1.2 凝胶滞后实验 1.2.1 凝胶滞后实验 1.2.2 超级凝胶电泳 1.3 干扰实验 1.3.1 甲基化干扰实验 1.3.2 尿嘧啶干扰实验 1.4 脱氧核糖核酸酶足迹分析 1.5 随机 PCR 1.5.1 寡核苷酸的设计与合成 1.5.2 寡核苷酸的纯化 1.5.3 探针标记 1.5.4 凝胶滞后实验纯化探针 1.5.5 特异结合序列的克隆与序列分析 1.6 核酸-蛋白质杂交实验 1.6.1 电泳及电转移 1.6.2 标记探针 1.6.3 蛋白质变性、复性 1.6.4 杂交及放射自显影 参考文献 第 2 章 cDNA 文库构建及目的基因的筛选 2.1cDNA 第一条链的合成 2.1.1cDNA 第一条链合成的策略 2.1.2cDNA 第一条链合成的操作步骤 2.2cDNA 第二条链的合成 2.2.1 置换合成法 2.2.2PCR 法 2.3cDNA 克隆的其他策略 2.3.1 加尾载体作引物引导 cDNA 合成定向克隆 2.3.2Okayama-Berg 克隆法定向克隆 2.3.3 末端加尾直接克隆非定向克隆 2.3.4 加接头直接克隆非定向克隆（双链 cDNA 末端无酶切位点） 2.3.5 加接头克隆定向克隆（双链 cDNA 一端带酶切位点） 2.3.6 加连接于克隆非定向克隆（双链 cDNA 末端无酶切位点） 2.3.7 加连接子克隆定向克隆（双链 cDNA 一个末端带有酶切位点） 2.3.8PCR 产物的直接克隆 非定向克隆 2.3.9PCR 产物的黏瑞克隆法 定向克隆（两个 PCR 引物均带酶切位点） 2.3.10 无连接酶克隆法 2.4 重组子的筛选与鉴定 2.4.1 根据遗传表型筛选 2.4.2 分析重组子结构特征的筛选法 2.5 构建 cDNA 文库新方法 2.5.1 减数 cDNA 文库 2.5.2 标准化 cDNA 文库 2.6mRNA 差示显示技术 2.6.1 基本原理和方法 2.6.2 优化反应条件 2.6.3 差异显示技术在生物医学中的应用 2.6.4 差异显示技术存在的问题及改良措施 2.6.5 差异显示技术与相关方法的比较 2.6.6 差异显示技术的展望 2.7 人类基因组计划及后基因组计划 2.7.1 物理图谱的制作 2.7.2 测序及寻找新的功能因子 2.7.3 人类后基因组计划 参考文献 第 3 章 抗体工程 3.1 基因工程抗体的免疫学基础 3.1.1 免疫应答 3.1.2 抗体的分子结构和功能 3.1.3 抗体基因的 DNA 重排 3.1.4 抗体库的产生 3.1.5 抗原抗体的结合 3.2 噬菌体表面表达技术与噬菌体抗体 3.2.1 表达 Fab 段抗体的 pComb3 载体系统 3.2.2 表达 scFv 单链抗体 pHEN1 和 pCANTAB5E 的载体系统 3.2.3 抗体基因在大肠杆菌中的转录和翻译 3.2.4Fab 抗体或 scFv 抗体在细胞膜间隙的组装 3.2.5 用于噬菌体抗体表达系统的大肠杆菌菌株 3.3 基因工程重组抗体Fab 抗体 3.3.1 淋巴细胞的分离纯化 3.3.2 总细胞 RNA 的提取 3.3.3cDNA 的合成 3.3.4PCR 扩增 Fab 抗体基因 3.3.5PCR 产物的纯化 3.3.6Fd 和轻链基因的克隆及噬菌体抗体库的建立 3.3.7 噬菌体抗体库的富集筛选 3.3.8 噬菌体抗体库的菌落筛选法 3.3.9Fab 抗体在原核细胞中的可溶性表达 3.3.10 电转感受态菌 XILBlu 的制备 3.3.11 电转感受态菌 TG1 的制备 3.3.12 辅助噬菌体毒种制备 3.3.13 噬菌体毒种的滴定 3.4 基因工程重组抗体单链抗体 scFv 3.4.1 淋巴细胞的分离纯化 3.4.2 总细胞 RNA 的提取和 cDNA 的合成 3.4.3PCR 扩增抗体可变区基因及 scFV 单链抗体基因 3.4.4Linker 连接片段的制备 3.4.5 人单链 Fv（scFv ）片段的组装 3.4.6scFv 单链噬菌体抗体库的构建 3.4.7 单链噬菌体抗体库的富集筛选 3.4.8scFv 单链抗体融合表达和可溶性表达 3.5Fab 段抗体和 scFv 单链抗体表达产物的纯化和鉴定 3.5.1 抗 Fab 抗体亲和层析纯化法 3.5.2Protein A-Sepharose 柱层析纯化 3.5.3 金属离子亲和层析柱纯化 3.5.4Fab 抗体或 scFV 抗体的特异性鉴定 3.5.5 重组抗体可变区基因序列测定及分析 3.6 重组抗体全免疫球蛋白基因的表达 3.6.1 可变区基因与恒定区基因的连接全抗体基因在哺乳类细胞中的表达 3.6.2 全 IgG 抗体基因的表达系统重组杆状病毒系统 参考文献 第 4 章 丝状噬菌体表面显示技术的基本原理和应用 4.1 概述 4.1.1 丝状噬菌体的基本特征 4.1.2 噬菌体显示的基本原理和优势 4.1.3 噬菌体显示技术的发展和意义 4.1.4 噬菌体显示的基本策略 4.2 噬菌体随机多肽文库 4.2.1 概述 4.2.2 构建噬菌体肽库的操作步骤 4.3 噬菌体在 cDNA 文库表达和筛选中的应用 4.3.1pJuFo 载体的概述 4.3.2pJufo 载体应用举例 4.3.3pJuFo 系统的筛选 4.3.4pJuFo 系统的应用 4.3.5pJuFo 系统优势和限制因素 4.4 噬菌体在蛋白质改造中的应用 4.4.1 选择突变蛋白质的一般原则 4.4.2 实验设计的一般步骤和程序 4.5 影响噬菌体筛选效率的因素 4.5.1 表达水平对筛选效率的影响 4.5.2 亲和力对筛选效率的影响 4.6 噬菌体表面显示技术相关的信息资源 4.6.1 噬菌体肽库和抗体库 4.6.2 抗噬菌体抗体 4.6.3 如何分析筛选结果 4.6.4 分子文库的 www 网址 参考文献 第 5 章 聚合酶链反应 5.1 基本 PCR 技术 5.1.1 基本步骤 5.1.2 实验条件的优化 5.2RTPCR 5.2.1 基本步骤 5.2.2 简化步骤 5.2.3 影响因素 5.3 单侧（锚式）PCR 5.3.1 扩增已知序列的下游片段 5.3.2 扩增已知序列的上游片段 5.3.3 注意事项 5.4 差异显示 PCR 5.4.1 实验步骤 5.4.2 注意事项 5.5 免疫 PCR 5.5.1 实验步骤 5.5.2 注意事项 5.6PCRELISA 5.6.1 实验步骤 5.6.2 注意事项 参考文献 第 6 章 实用 DNA 突变技术 6.1 无表型选择的寡核苷酸介导的突变 6.1.1 突变原理 6.1.2 实验操作步骤 6.1.3 注意事项 6.2 简并寡核苷酸诱变 6.2.1 突变原理 6.2.2 实验操作步骤 6.2.3 注意事项 6.3 基因人工合成 6.3.1 突变原理 6.3.2 实验操作步骤 6.3.3 注意事项 6.4 区域特异性突变 6.4.1 突变原理 6.4.2 实验操作步骤 6.4.3 注意事项 6.5DNA 的接头分区突变 6.5.1 突变原理 6.5.2 使用巢式缺失的互补寡核苷酸的接头分区突变(基本方案) 6.5.3 使用寡核苷酸定位的接头分区突变（替代方案） 6.5.4 注意事项 6.6PCR 介导的突变 6.6.1 通过 PCR 方法引入限制性酶切位点原理（基本方案 1） 6.6.2 实验操作步骤 6.6.3 通过 PCR 方法引入点突变原理（基本方案 2） 6.6.4 实验操作步骤 6.6.5 通过连续 PCR 引入点突变原理（替代方案） 6.6.6 实验操作步骤 6.6.7 注意事项 参考文献 第 7 章 外源基因在哺乳动物细胞中的表达 7.1 外源基因导入哺乳动物细胞中的技术方法 7.1.1 磷酸钙沉淀转染法 7.1.2DEAE-葡聚糖转染法 7.1.3 脂质体介导的转染 7.1.4 电穿孔转染法 7.1.5 基因枪粒子轰击法 7.1.6 受体介导的基因导入法 7.2 病毒载体介导的基因转移 7.2.1 通过反转录病毒系统表达外源基因的原理 7.2.2 建立特异的产反转录病毒细胞系（基本方法） 7.2.3 通过腺病毒载体系统表达外源基因 7.3 报告基因的表达及检测 7.3.1 半乳糖苷酶基因 7.3.2 下氯霉素乙酸转移酶基因 7.3.3 荧光素酶基因 7.3.4 绿色荧光蛋白基因 7.3.5 人生长激素基因 7.3.6 分泌型的碱性磷酸酶基因 7.3.7-葡萄糖醛酸酶基因 7.4 外源基因的稳定表达 7.4.1 保留稳定转化细胞系的常用选择标记 7.4.2 分离稳定转化细胞系的基本步骤（基本方法） 参考文献 第 8 章 DNA 序列测定 8.1DNA 测序方法概述 8.1.1DNA 测序方法的分类 8.1.2DNA 测序的策略 8.1.3 双脱氧测序法和化学测序法的选择 8.1.4DNA 测序技术的进展 8.2 构建 DNA 测序用的嵌套缺失 8.2.1 用外切酶（Exo）构建单一方向的缺失（基本操作） 8.2.2 用-35SdNTPs 保护 DNA 使其免受外切酶（Exo）的消化 8.2.3 用 Bal31 核酸酶构建嵌套缺失（基本操作） 8.2.4 制备 M13mp 测序载体来亚克隆 Bal31 消化的 DNA 片段 8.2.5 注释 8.3DNA 序列测定模板的制备 8.3.1 单链 M13 噬菌体 DNA 的制备 8.3.2 从小量细胞裂解液中制备 DNA 模板 8.3.3 化学测序所需重组 Psp64CS 或 pSP65CS 质粒 DNA 的微量制备 8.3.4 双脱氧法测序所需双链质粒 DNA 的微量制备 8.3.5 双脱氧法测序所需双链质粒 DNA 的碱变性 8.3.6 从一个大肠杆菌菌落中制备质粒 DNA 或从一个噬菌斑中制备噬菌体 DNA 用于热循 环测序 8.3.7 注释 8.4DNA 双脱氧测序法 8.4.1 用测序酶（Sequenase）来标记终止测序反应（基本操作） 8.4.2 在标记终止反应中使用 Mn2+离子（替代操作 1） 8.4.3 在标记终止测序反应中使用其他 DNA 聚合酶（替代操作 2） 8.4.4 用 Klenow 片段进行 Sanger 法测序（基本操作） 8.4.5 利用 Taq DNA 聚合酶进行 Sanger 反应（替代操作） 8.4.6 利用 5末端标记引物进行一步法测序（替代操作 2） 8.4.7 利用同位素标记核苷酸进行热循环测序反应（基本操作） 8.4.8 利用 5端引物标记进行热循环测序反应（替代操作） 8.4.9 注释 8.5 用化学发光检测法进行 DNA 双脱氧测序 8.5.1 用生物素化引物进行化学发光检测的 DNA 测序（基本操作） 8.5.2 用链霉抗生物素蛋白和生物素化碱性磷酸酶进行两步（间接）检测（替代操作 1） 8.5.3 用半抗原标记引物进行测序，用抗体-碱性磷酸酶偶联物进行检测（替代操作 2） 8.5.4 注释 8.6 化学法测定 DNA 序列 8.6.1 策略设计 8.6.2 用 32P 标记 DNA 的化学测序（基本操作） 8.6.3Tth111I 消化和末端标记（替代操作） 8.6.4 注释 8.7 变性凝胶测定电泳 8.7.1 灌胶、电泳和测序凝胶的处理（基本操作） 8.7.2 缓冲液梯度测序凝胶（替代操作 1） 8.7.3 电解质梯度测序凝胶（替代操作 2） 8.7.4 含甲酰胺的测序凝胶（替代操作 3） 8.7.5 注释 参考文献 第 9 章 蛋白质的表达 9.1 外源基因在原核细胞中的表达 9.1.1 蛋白质在原核细胞中的表达特点 9.1.2 蛋白质在原核细胞表达的调控 9.1.3 蛋白质在原核细胞中的表达形式 9.1.4T7 启动子的原核表达系统 9.1.5 利用 pET 载体在大肠杆菌中表达外源基因的基本操作 9.2 外源基因在哺乳动物细胞内的表达 9.2.1 病毒介导的基因表达 9.2.2 重组痘苗病毒共表达汉坦病毒 M 和 S 片断的操作步骤 9.2.3 外源基因在哺乳动物细胞中的瞬时表达 9.2.4 痘菌病毒瞬时表达 T7 RNA 聚合酶的操作步骤 9.2.5 外源基因在哺乳动物细胞系中的稳定表达 9.2.6 哺乳动物细胞系稳定表达汉坦病毒 S 片断的操作步骤 9.3 外源基因在杆状病毒系统的表达 9.3.1 杆状病毒系统表达外源基因的特点和策略 9.3.2 杆状病毒表达汉坦病毒 M 片断的操作步骤 9.4 重组蛋白的检测和鉴定 9.4.1 免疫荧光（IFA）的原理和基本操作 9.4.2 酶联免疫吸附试验 9.4.3SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本操作 9.4.4 蛋白印迹试验的基本操作 9.4.5 放射免疫沉淀的原理和基本操作 参考文献 第 10 章 蛋白质与蛋白质相互作用的研究策略 10.1 蛋白质间相互作用的形式和作用力 10.1.1 蛋白质间相互作用的形式 10.1.2 蛋白质之间相互作用的作用力 10.2 蛋白质间相互作用的研究策略 10.2.1 蛋白质配体结合结构域的筛选 10.2.2 蛋白质配体的筛选 10.3 酵母双杂交系统的操作程序 10.3.1 酵母双杂交系统操作的基本流程 10.3.2 实验材料 10.3.3 基本实验方法 10.4 注释 参考文献 第 11 章 生物芯片技术 11.1 生物芯片技术的发展 11.2 生物芯片的类型 11.2.1 基因芯片 11.2.2 蛋白芯片 11.2.3