(2)hplc法校正因子研究中的几个问题

HPLC 法校正因子研究中的几个问题 张哲峰 化药药学二部 HPLC 法具有将不同物质分离后逐一定量的分离分析能力，在药品有关物质检测中发挥着越 来越重要的作用，成为药品杂质控制中常用而有效的手段之一。在杂质对照品法、加校正因 子的主成分自身对照法、不加校正因子的主成分自身对照法、峰面积归一化法等几种常用的 杂质定量方式中，校正因子的研究对于选择合适定量方式，准确定量杂质具有重要意义，因 而成为杂质分析方法研究中的重要内容之一。但从目前注册申报资料实际情况来看，校正因 子的研究和使用中尚存在一些需要进一步思考和关注的问题。 1.校正因子的定义及特点 一般来讲，HPLC 定量测定中，物质的检测量 W 与色谱响应值（峰面积等）A 之间的比 值称为绝对校正因子，即单位响应值（峰面积等）所对应的被测物质的量（浓度或质量） ； 而某物质 i 与所选定的参照物质 s 的绝对校正因子之比，即为相对校正因子，即通常所讲的 校正因子。 目前校正因子主要用于“加校正因子的主成分自身对照法” 定量相关特定杂质，这种定量 方式因考虑了杂质与主成分的绝对校正因子的不同所引起的测定误差，将标准物质的赋值信 息转化为常数，固化在质量标准中，且不需长期提供标准物质，因而成为现阶段杂质控制较 为理想可行的手段。但这种方法有时会因不同仪器及色谱条件的波动，可产生一定范围的误 差，需进行充分的方法耐用性验证，并结合色谱峰定位控制等措施，将误差控制在一定范围 内。 2.校正因子的测定 在校正因子的研究和使用中，标准物质、色谱条件、溶剂、检测波长等均是重要的影响 因素，研究中需要予以关注。 2.1 校正因子的测定需要用到特定杂质及主成分的标准物质，这些标准物质应具备量值 准确的特点，符合标准物质（对照品）的相关要求；其次，确定校正因子的分析方法应与最 终确定的质量标准方法一致，色谱条件等需经筛选优化后确定，如有变更，需考虑对校正因 子的影响，必要时重新确定；第三，要关注影响待测物 UV 吸收的各种因素，如溶液制备所 用溶剂最好与最终确定的流动相相同，检测波长最好在特定杂质及主成分 UV 曲线的峰或谷 处，避开吸收值急剧变化波段，以保证测定方法具有较好的耐用性，并保持测定结果的恒定。 2.2 一般情况下，校正因子可视具体情况通过如下几种方法确定： （1）单浓度点测定：制备适当浓度的特定杂质对照品溶液和主成分对照品溶液，分别 进样测定，照上式计算，得到校正因子。 （2）多浓度点测定：制备适当的高、中、低三水平浓度的特定杂质对照品溶液和主成 分对照品溶液（涵盖定量限、标准限度） ，分别进样测定，照上式计算各校正因子，计算 RSD，求平均值，得到校正因子。 （3）标准曲线法测定：精密称取杂质对照品和主成分对照品，分别制备系列溶液（涵 盖定量限、标准限度） ，分别进样后，按最小二乘法以进样量对响应值（峰面积等）进行线 性回归，求得两条标准曲线，两曲线斜率之比即为校正因子。 （4）吸收系数比值法：对于 UV 检测器来讲，两物质的相对校正因子实际上也是两物 质以流动相为溶剂，在检测波长处的紫外吸收系数 E1cm1%之比，故可按吸收系数法测定法 的相关技术要求测定各自吸收系数，如对照品级别的标准物质、高中低三水平浓度测定、吸 收度介于 0.30.8 之间、至少 5 台不同型号的 UV 分光光度计、2 份供试液同时平行制备测 定、同台仪器 2 份供试液的平行测定结果不超过0.5%等。测定两物质的吸收系数后，经统 计分析确定两物质吸收系数，计算比值，求得校正因子。 上述各方法中， （1）和（2）法较为简捷，可以快捷地量化特定杂质与主成分紫外吸收 特征的差异，多用于评估采用主成分自身对照法定量杂质时是否需要校正。但如采用加校正 因子的主成分自身对照法定量杂质，需将标准物质赋值信息转化为校正因子固化在质量标准 中，那么校正因子的准确性非常关键，校正因子的准确计算应符合更为严格的要求，需要考 虑并控制求算校正因子过程中的各种误差因素，以及仪器通用性和色谱系统的耐用性等因素， 以便使求得的常数更为准确并具代表性，此时采用（3） 、 （4）法更为适宜，如能考虑到测定 人员、不同试验室因素的影响，会更加符合常数求算的基本要求。 3.校正因子的应用 根据杂质研究相关技术指导原则，为确保杂质测定结果的准确可靠，一般情况下，校正 因子在 0.91.1 时可不予校正，直接采用不加校正因子的自身对照法定量；超出该范围，如 采用主成分自身对照法的定量方式，须用校正因子进行校正， ，即“加校正因子的主成分自身 对照法”以保证杂质定量的准确性；如校正因子在 0.25.0 范围以外时，表明杂质与主成分 的 UV 吸收相差过大，校正因子的作用会受到显著影响，此时应改变检测波长等检测条件， 使校正因子位于上述范围内，或使用结构或 UV 吸收与该杂质接近的另一标准物质为参照物 质（如对照品易于获得、标准已采用对照品外标法定量的另一特定杂质） ，重新确立校正因 子；如校正因子仍无法调节至适当范围，需考虑采用杂质对照品外标法等适当的杂质方式定 量。 校正因子的应用同吸收系数的使用类似，需要具备一定的前提条件，比如相同的检测波 长、分析方法、色谱条件等。需要注意的是，杂质的保留时间差别较大时，峰形及峰面积会 有较大差别，对校正因子的校准作用也会产生明显影响，因此色谱峰的保留时间要相对恒定， 质量标准需要对相关特定杂质的色谱峰规定相对保留时间的限定。 在目前的申报资料中，校正因子的研究和使用中存在一些需要关注的问题。主要表现在 如下几个方面： （1）特定杂质直接采用主成分自身对照法定量，没有进行校正因子的研究以及测定结 果校正前后的数据对比，无法判断定量方式的合理性和测定结果的准确性。 （2）测定的校正因子超过指导原则中不需校正的范围，仍直接采用不加校正因子的主 成分自身对照法。如某药物中杂质 I、II、III 校正因子分别为 2.02、1.47、1.70，但质量标准 仍采用不加校正因子的主成分自身对照法测定包括上述三个杂质的各种杂质。 （3）测得的校正因子不能有效校正测定结果，在没有充分的数据支持的情况下，仍采 用加校正因子的主成分自身对照法。如某青蒿素质量标准中去氢青蒿素的定量使用相对于主 成分的校正因子为 0.019，该数值校正能否准确定量杂质，没有相应研究工作的论证和对比 检测数据的支持显然是不够的。 4.几点思考与建议 综上可见，对于特定杂质的控制，校正因子的研究和测定是非常必要的。评估杂质定量 是否需要采用校正因子校正，校正因子能否起到有效的校准作用，首先要测定出校正因子， 按照相关技术指导原则的要求评估是否需要校正，并提供相应的对比研究资料。这些研究数 据应包括杂质对照品外标法、加校正因子的主成分自身对照法、不加校正因子的主成分自身 对照法对相同多批样品杂质定量测定结果的对比数据，作为是否需要校正或能否有效校正检 测结果的支持与依据。 考虑到校正因子对杂质定量的长期影响，目前阶段校正因子测定的技术要求、标准物质 要求、测定方法和数据处理的要求等尚未十分明确、尚不统一普及，如校正因子需要载入质 量标准，由省所进行协作标定或进行针对性技术复核具有一定必要性。 以上所述仅为个人观点，不妥之处期望讨论交流。 参考文献 1、国家食品药品监督管理局 化学药物杂质研究的技术指导原则。2005 2、ICH Harmonized Tripartite Guideline ：Impurities in New drug substances,Q3A (R).2002 3、BP2011：British Pharmacopoeia Volume V-Appendices-Appendix III Chromatographic Separation Techniques 4、ICH Harmonized Tripartite Guideline ：Impurities in New drug s