色谱分析原理及应用

III 篇章 色谱分析法 第 19章 色谱法分离原 理 一、 色谱法概述 二、有关术语 三、色谱法基本理论 四、分离度 五、定性定量分析 * 第一节 色谱法概述 一、 色谱法的特点、分类和作用 1.概述 2.分类 3.特点 Date 一、 色谱法的特点、分类和作用 1.概述 俄国植物学家茨维特在 1906年使用的装置： 色谱原型装置，如图。 色谱法是一种分离技术 ， 试样混合物的分离过程也就是试样中各组 分在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的 分配过程。 其中的一相固定不动，称为 固定相 ； 另一相是携带试样混合物流过此固定相的 流体（气体或液体），称为 流动相 。 （ 动画 ） Date 色谱法 当流动相中携带的混合物流经固定相时， 其与固定相发生相互作用。由于混合物中各组 分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生 的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移 动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡 ，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而 按一定次序由固定相中流出。与适当的柱后检 测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检 测。 两相及两相的相对运动构成了色谱法的基础 Date 2.色谱法分类 气相色谱 ： 流动相为气体（称为载气）。 按分离柱不同可分为：填充柱色谱和毛细管柱色谱； 按固定相的不同又分为：气固色谱和气液色谱 Date 液相色谱 液相色谱 ： 流动相为液体（也称为淋洗液）。 按固定相的不同分为：液固色谱和液液色谱，键合相色谱 离子色谱 ： 液相色谱的一种，以特制的离子交换树脂为固 定相，不同 pH值的水溶液为流动相。 Date 其他色谱方法 薄层色谱和纸色谱： 比较简单的色谱方法 凝胶色谱法 : 超临界色谱 : 高效毛细管电泳 : 九十年代快速发展、 特别适合生物试样分析分 离的高效分析仪器。 Date 迎头色谱，顶替色谱和洗脱色谱 Date 第二节 有关术语 分配系数 K 组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、 挥发的过程叫做分配过程。在一定温度下，组分在两相间 分配达到平衡时的浓度（单位： g / mL） 比，称为分配系数 ，用 K 表示，即： Date 分配系数 K的讨论 一定温度下，组分的分配系数 K越大，出峰越慢； 试样一定时， K主要取决于固定相性质； 每个组份在各种固定相上的分配系数 K不同； 选择适宜的固定相可改善分离效果； 试样中的各组分具有不同的 K值是分离的基础； 某组分的 K = 0时，即不被固定相保留，最先流出。 Date 分配系数 K与浓度无关，即分配等温线是 线形的。 Date 一、 色谱流出曲线 1.基线 无试样通过检测器时， 检测到的信号即为基线。 2.保留值 （ 1）时间表示的保留值 保留时间（ tR）： 组分从进样到柱后出现浓度极 大值时所需的时间 死时间（ tM）： 不与固定相作用的组分（如空气 ）的保留时间。 调整保留时间（ tR ）： tR = tR tM （动画） Date （ 2）用体积表示的保留值 保留体积（ VR）： VR = tRF0 （ F0为色谱柱出口处的流动相流量， 单位： m L / min。） 死体积（ VM）： VM = tM F0 调整保留体积（ VR）： V R = VR VM Date 3. 相对保留值 r21 组分 2与组分 1调整保留值之比： r21 = tR2 / tR1= VR2 / V R1 相对保留值只与柱温和固定相性质有关， 与其他色谱操作条件无关，它表示了固定相 对这两种组分的选择性。 Date 4. 区域宽度 用来衡量色谱峰宽度的参数， 有三种表示方法： （ 1）标准偏差 ()： 即 0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半。 （ 2）半峰宽 (Y1/2)： 色谱峰高一半处的宽度 Y1/2 =2.354 （ 3）峰底宽 (Wb)： Wb=4 Date 二、容量因子与分配系数 分配系数 K： 组分在两相间的浓度比； 容量因子 k： 平衡时，组分在各相中总的质量比； k =MS / Mm MS为组分在固定相中的质量， Mm为组分在流动相中的质量。 容量因子 k与分配系数 K的关系为： 式中 为相比。 填充柱相比： 6 35； 毛细管柱的相比： 50 1500 容量因子越大，保留时间越长。 可由保留时间计算出容量因子，两者有以下关系： Date 第三节 色谱法基本理论 Date 一、塔板理论 -柱分离效能指标 色谱柱长： L， 虚拟的塔板间距离： H， 色谱柱的理论塔板数： n， 则三者的关系为： n = L / H 理论塔板数与色谱参数之间的关系为： Date 有效塔板数和有效塔板高度 单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高。 用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。 组分在 tM时间内不参与柱内分配。需引入有效塔 板数和有效塔板高度： Date 塔板理论的特点和不足： (1)当色谱柱长度一定时，塔板数 n 越大 (塔板高度 H 越小 )，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高 ，所得色谱峰越窄。 (2)不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效 塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明 测定物质。 (3)柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组 分的分配系数 K 相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都 无法分离。 (4)塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下 柱效不同的实验结果，也无法指出影响柱效的因素及提高 柱效的途径。 Date 二、 速率理论 -影响柱效的因素 速率方程（也称范 .弟姆特方程式） : H = A + B/u + Cu H：理论塔板高度， u：载气的线速度 (cm/s) 减小 A、 B、 C三项可提高柱效； 存在着最佳流速； A、 B、 C三项各与哪些因素有关？ Date 1. 涡流扩散项 A A = 2dp dp： 固定相的平均颗粒直径 ： 固定相的填充不均匀因子 固定相颗粒越小 dp，填充的越均匀， A， H，柱效 n。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰 较窄。 Date 2. 分子扩散项 B B = 2 Dg ： 弯曲因子，填充柱色谱， 1。 Dg：试样组分分子在气相中的扩散系数（ cm2s-1）。 由于 柱中存在着浓度差，产生纵向扩散： a. 扩散导致色谱峰变宽， H(n)， 分离变差。 b. 分子扩散项与流速有关，流速 ，滞留时间 ，扩散 c. 扩散系数： Dg （ M载气 ） -1/2 ； M载气 ， B值 Date 3.传质阻力项 C 组分在气相和液相两相间进行反复分配时，遇到阻力 。 传质阻力包括气相传质阻力 Cg和液相传质阻力 CL ，液相传 质阻力大于气相传质阻力。 即： C =（ Cg + CL） Date 流动相的传质阻力 ： 发生在气相和气液界面 与 dp2/Dg成正比 采取小颗粒，质量小的气体 固定相传质阻力 ： 发生在气液界面和固定相之间 与 df2/Dl成正比 Df 为液膜厚度； Dl 为组分在液相中的扩 散系数 Date 4. 载气流速与柱效 -最佳流速 载气流速高时： 传质阻力项是影响柱效 的主要因素， 流速 ，柱效 , 右图曲线的右边。 载气流速低时： H - u曲线与最佳流速： 由于流速对这两项完全相反的作用，流速对柱效的总影 响使得存在着一个 最佳流速 值，即速率方程式中塔板高度对 流速的一阶导数有一极小值。 以塔板高度 H对应载气流速 u作图，曲线最低点的流速即 为 最佳流速 。 分子扩散项成为影响柱效的 主要因素， 流速 ，柱效 ， 右图曲线的坐边。 Date 5. 速率理论的要点 (1)组分分子在柱内运行的 多路径与涡流扩散 、 浓度梯度所 造成的 分子扩散 及 传质阻力 使气液两相间的分配平衡不能瞬 间达到等因素是造成色谱峰扩展柱效下降的主要原因。 (2)通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载 气流速可提高柱效。 (3)速率理论为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。 阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。 (4) 各种因素相互制约，如载气流速增大，分子扩散项的影 响减小，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使 柱效下降；柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散的 影响，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。 Date 第四节 分离度 塔板理论和速率理论都难以描述难分离物质对的实际分 离程度 。即柱效为多大时，相邻两组份能够被完全分离。 难分离物质对的分离度大小受色谱过程中两种因素的综 合影响：保留值之差 色谱过程的热力学因素； 区域宽度 色谱过程的 动力学 因素。 色谱分离中的四种情况如图所示： 柱效较高， K (分配系数 ) 较大 ,完全分离； K 不是很大，柱效较高 ，峰较窄，基本上完全分离； 柱效较低， K 较大 ,但 分离的不好； K 小， 柱效低，分离效 果更差。 Date 分离度的表达式： R =0.8：两峰的分离程度可达 89%； R =1.0：分离程度 98%； R =1.5：达 99.7%（ 相邻两峰完全分离的标准 ）。 Date 令 Wb(2)=Wb(1)=Wb（ 相邻两峰的峰底宽近似相等 ）， 引 入相对保留值和塔板数，可导出下式： Rs=1/4 * (-1)/ * n 1/2* K2/(1+k2) (（ 1+k2 ） /k2)2 /U *(1+k2 )3/k22 Date 分离度与柱效（动力学因素），选择因 子（热力学因素），和容量因子（容量 因素）有关 1, 分不开 改 变 流 动 相的 组 成；温度；固定相 组 成 ；特殊反 应 n,改 变 流 动 相的流速，黏度；液膜厚度 ，柱 长 k,1-5 Date 例题 1： 在一定条件下，两个组分的调整保留时间分别为 85秒和 100秒，要达到完全分离，即 R=1.5 。 计算需要多少块有效 塔板。若填充柱的塔板高度为 0.1 cm， 柱长是多少？ 解： r21= 100 / 85 = 1.18 n有效 = 16R2 r21 / (r21 1) 2 = 161.52 (1.18 / 0.18 ) 2 = 1547（ 块） L有效 = n有效 H有效 = 15470.1 = 155 cm 即柱长为 1.55米时， 两组 分可以得到完全分离。 Date 例题 2： 在一定条件下，两个组分的保留时间分别为 12.2s和 12.8s， 计算分离度。要达到完全分离，即 R=1.5 ， 所需要的 柱长。 n=3600 解： 分离度： 塔板数增加一倍，分离度增加多少？ Date 第五节 定性和定量分析 * 一、 色谱定性鉴定方法 1.利用纯物质定性的方法 利用保留值定性 ： 通过对比试样中具有与纯物质相同 保留值的色谱峰，来确定试样中是否含有该物质及在色谱 图中位置。不适用于不同仪器上获得的数据之间的对比。 利用加入法定性 ： 将纯物质加入到试样中，观察各组 分色谱峰的相对变化。 2.利用文献保留值定性 相对保留值 r21： 相对保留值 r21仅与柱温和固定液性质 有关。在色谱手册中都列有各种物质在不同固定液上的保 留数据，可以用来进行定性鉴定。 Date 3.保留指数 p380 又称 Kovats指数（ ），是一种重现性较好的定性参数。 测定方法： 将正构烷烃作为标准，规定其保留指数为分子中碳原子 个数乘以 100（如正己烷的保留指数为 600）。 其它物质的保留指数（ IX） 是通过选定两个相邻的正构 烷烃，其分别具有 Z和 Z 1个碳原子。被测物质 X的调整保留 时间应在相邻两个正构烷烃的调整保留值之间如图所示： Date 保留指数计算方法 Date 3.与其他分析仪器联用的定性方法 小型化的台式色质谱联用仪（ GC-MS； LC-MS） 色谱 -红外光谱仪联用仪； 组分的结构鉴定 Sample Sample 5890 1.0 DEG/MI N HEWLETT PACKARD HEWLET TPACKAR D 5972A Mass Selectiv e Detecto r D C B A A B C D Gas Chromatograph (GC) Mass Spectrometer (MS) Separation Identification B A C D Date 二、 色谱定量分析方法 1. 峰面积的测量 （ 1）峰高 （ h） 乘半峰宽 （ Y 1/2） 法： 近似将色谱峰当作等 腰三角形。此法算出的面积是实际峰面积的 0.94倍： A = 1.064 hY1/2 （ 2）峰高乘平均峰宽法： 当峰形不对称时，可在峰高 0.15 和 0.85处分别测定峰宽，由下式计算峰面积： A = h（ Y 0.15 + Y 0.85 ） / 2 （ 3）峰高乘保留时间法： 在一定操作条件下，同系物的半 峰宽与保留时间成正比，对于难于测量半峰宽的窄峰、重叠 峰（未完全重叠），可用此法测定峰面积： A = hbtR （ 4）自动积分和微机处理法 Date 2. 定量校正因子 试样中各组分质量与其色谱峰面积成正比，即： m i = fi Ai 绝对校正因子 ：比例系数 f i ，单位面积对应的物质量： f i =m i / Ai 定量校正因子与检测器响应值