第二章植物组织与细胞培养技术（201410）幻灯片

第二章 植物组织与器官培养 第一节 基础知识 第二节 组织培养的一般过程 第三节 植物组织器官培养 第四节 细胞培养 第五节 植物原生质体培养 组织培养与细胞培养的区别： v 组织培养 ： 指取出机体内组织与细胞，模拟机体内生 理条件，使之在体外生长成 组织或完整植株； v 细胞培养 ： 植物细胞在体外条件下的存活或生长，不 再形成组织，以 生产次生代谢产物为目的。 第一节 基础知识 Clone分动词和名词。动词为无性繁殖，名 词为无性繁殖后代（无性系）。通俗地讲就 是 Genetically replicate or copy. Calliclone(愈伤组织无性系） Protoclone（原生质体无性系） Somaclone Gametoclone等 Plant tissue culture: 将整个植株、器官、组织、细 胞、甚至细胞器进行离体的无菌的培养（广义）。 诱导愈伤组织进而再增殖分化的培养技术（狭义） 。 Explant:用于离体培养的植物组织切段。 Organ Culture: 根、茎、叶、花、果实、种子等。 Suspension cell culture: 液体中分散良好的细胞或小 细胞团的培养。 Callus (pl Calli) 愈 伤组织 : 由母体组织脱分化产生 的一团不定型的疏松的薄壁细胞。没有明显的器官 组织分化。但是细胞大小、形态、液泡化程度、细 胞质含量、细胞壁的特性等与正常组织存在很大的 差异 。 Organ formation/genesis： 愈伤组织分化形成根和 芽的过程。 Embryoid(胚状体 ): 指在组织和细胞培养中，起源于 非合子细胞 ，经过多次分裂产生的一种与胚相似的结 构。 1. 是组织和细胞培养的产物，以区别自然界中无融合 生殖 （ Apomixes） 产生的胚； 2. 起源于非合子细胞 以区别于精卵结合而形成的合子胚 （ Zygotic embryo ） ； 3.具有胚根胚芽和胚轴的完整结构并与外植体的 维管组织无联系而区别于组织培养中的不定芽或不定 根。 Artificial/Synthetic/Man-made/Somatic seed ： 将植物离体培养产生的胚状体（主要指体细胞胚 ）包裹在含有养分和具有保护功能的物质中形成的 在适应条件下能够发芽出苗的颗粒体 人工种子 是由体细 胞胚、人工胚乳和人 工种皮三个部分组成 优点 ： （ 1）难以保存的种质资源 （ 2）固定杂种优势 （ 3）可加入农药肥料及激素，人为控制植物 的生长发育和抗逆性 （ 4）是植物基因工程和细胞工程应用于生产 的桥梁 。 人工种子存在的问题 许多重要植物还不能培养出大量的高质量的体 细胞胚 ; 现有的人工胚乳和种皮还不够理想，不能有效 地防止微生物的腐蚀 ; 人工种子的贮藏有待进一步完善。 茎尖分生组织培养再生植株 Shoot tip culture： 几 mm至几十 mm的茎尖 病毒检测 脱毒苗的繁殖 一个植物细胞向分生状态回复过程所能进 行的程度，取决于它在 自然部位上所处位 置和生理状态。 第二类 第三类 根据细胞类型不同从强到弱 : 营养生长中心 形成层 薄壁细胞 厚壁细胞（木 质化细胞） 特化细胞（筛管、导管细胞） 根据细胞所处的组织不同从强到弱： 顶端分生组织 居间分生组织 侧生分生组织 薄 壁组织（基本组织） 厚角组织 辅导组织 厚壁 组织 细胞分生能力比较 外植体 脱分化 个体再生再分化 细胞分裂 细胞全能性的表达是通过 细胞脱分化 和 再分化 实现的，在 大多数情况下，脱分化是细胞全能性表达的前提，再分化 是细胞全能性表达的最终体现。 细胞脱分化 1、脱分化（ Dedifferentiation）： 也称去分化，指离体 条件下生长的细胞、组织或器官经过细胞分裂或不分裂 逐渐 失去原来的结构和功能而恢复分生状态 ，形成无组 织结构的细胞团或愈伤组织或不分化细胞的过程。 （ 1） 损伤 。切割损伤的刺激，促使细胞增殖。 （ 2） 激素。 （ 3） 弱光或黑暗条件 有利于脱分化中的细胞分裂。 （ 4） 细胞位置 。外植体本身的各类细胞可能对培养条件的刺激 有不同的敏感性。 （ 5） 外植体的生理状态 。不同生理年龄和不同季节都会有不同 的培养反应。 （ 6） 植物种类的差异 。 一般双子叶植物比单子叶植物及裸子 植物容易。 影响脱分化的主要因素影响脱分化的主要因素 u 诱导期 ：是细胞准备分裂的时期。细胞大小不变，内 部发生生理生化变化，迅速合成蛋白质和核酸。 u 分裂期 ： 诱导期后，外植体外层细胞分裂，在组织受 伤表面形成一层愈伤组织， 中间细胞常不分裂，形成 小芯 。细胞分裂快，结构疏松，缺少结构，浅而透明 。 质地类型： 松脆和致密 两种。高浓度生长素，可使 Callus变得松 脆；高浓度细胞分裂素，则可使致密 脱分化过程脱分化过程 （愈伤组织形成（愈伤组织形成 ） 黄瓜子房组织经脱分化形成胚性愈伤组织 细胞再分化（ redifferentiation） 1、概念 ：指离体培养的植物细胞和组织可以由 脱分化状态重新进行分化，形成另一种或几种类型 的细胞、组织、器官，甚至形成完整植株。 1 实验室设计与设备 2 实验基本操作 3 培养基的成分及其配制 4 培养条件的选择 组织培养的一般过程 实验室设计原则 ： 保证无菌操作 ，达到工作方便 ， 防止污染 。 v 利用 一 定的设备、器材和特殊的实验室结构设计 ，达到严格无菌的条件 v 按 组织培养流程 来设计，避免某些环节倒排，引 起日后工作混乱 一、实验室设计与设备 基本的工艺流程：基本的工艺流程： 容器具洗涤，物质准备 配置培养基并灭菌 外 植体消毒与无菌操作接种 观察、记录、处理（ 脱分化、再分化、继代） 再生植株 标准的组培实验室 洗涤室、准备室、无菌室、培养室等 灭菌设备：高压蒸气灭菌锅 用于 培养基、蒸馏水和接种器械 的灭菌消毒。 工作原理：在密闭的蒸锅内， 0 1MPa的压力下，锅内温 度达 121 。在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及 其高度耐热的芽孢。 注意事项： 对高压灭菌后不变质的物品，如无菌水、栽培介质、 接种用具，可以 延长灭菌时间或提高压力 。而培养基要 严格遵守保压时间，既要保压彻底，又要防止培养基中 的成分变质或效力降低，不能随意延长时间； 高压灭菌前后的培养基，其 pH值下降 0.2-0.3单位。因 此，调 PH值时，可适当 调高 0.2 0.3个单位。 (2).接种设备： 无菌超净工作台用于培养 材料的消毒及接种 。 使用前，将超净工作台上面的排风和杀菌按钮开启，灭菌 15min后 ，关闭杀菌按钮，打开照明按钮，即可在上面进行操作。 酒精灯 封口膜 接种器具 培养瓶 (3).培养设备 带日光灯的培养架，主要用于接种后材料的培养 。 恒温箱： 又称培养箱，可用于原生质体 和酶制剂的保温，也可用于组织培养材 料的保存及暗培养。 摇床： 在液体培养基中，可改善培养基中的培养 材料的通气状况。如从疏松的愈伤组织中获得单个 细胞。但注意要设定适合的温度及转速。 (4).驯化设备 温室 防虫网室 (5)、其它辅助设备 培养基灌装机及洗瓶机 烘箱 ： 用于干燥洗净后的玻 璃器皿，还可用 80 的温度烘 干组织培养植物材料以测定干 物质。 冰箱： 用于在常温下易变 性或失效的试剂和母液的储 藏，细胞组织和试验材料的 冷冻保藏，以及某些材料的 预处理。 天平和显微镜： 天平包括分析 天平，电子天平等，用于制备母 液时培养基组成成分的称取。如 一些需要量少的激素和微生素类 物质，天平的精确度要到 0.0001g，这就要求精确度更高 的分析天平。 纯水机与蒸馏水发 生器： 是实验室必备的仪器 。 酸度计 ： 用于校正培养基和酶制剂的 PH。 显微镜 包括解剖镜，生物显微镜，倒置显微镜 等。如茎尖的分离则需要解借助解剖镜。 除湿机 ： 使培养 室的湿度保持在 定的范围内。 空调机 ： 用于接种室 和培养室温度的控制。 实验基本操作 灭菌工作是极其重要的 有菌 和 无菌 的范畴： 有菌： 凡是暴露在空气中的物体，至少其表面都是有 菌的。 如植物的表面、超净工作台的台面，未处理的 工具和手等 。 无菌 ：高压高温处理（工具、器皿、培养基等） 物理或化学处理； 火烤后的物体； 健康的动植物不与内外部表面接触的组织 1、 物理方法 ：干热、湿热、过滤（ 0.25微 米） 、紫外灯、超声波等。 2、 化学方法 ：使用灭菌剂或抗菌素，如酒 精、次氯酸钠、升汞、漂白粉、高锰酸钾、 双氧水、福尔马林等 灭菌的方法 适用于玻璃器皿和金属器械的灭菌。操作方法： 150 、 40min或 120 、 120min，如果发现 芽孢 杆菌 ， 160 、 90 120min （ 1）干热灭菌 适用于各种器皿、培养基、器皿、 蒸馏水、棉塞、纸 等。 121 维持 20 30min （ 2）湿热灭菌 培养基的灭菌一般用高压高温处理，但如果培 养基中某些成分遇到 高温分解 （如某些生长调节剂 GA3、 IAA 、抗生素等），就需要过滤灭菌。另外 酶、血清等也需要过滤灭菌 灭菌方法：将生长调节剂或酶配成一定浓度， 用注射器注入微孔滤膜，滤膜孔径 0.22 0.45微米 。制培养基时，现将培养基高压灭菌，待降至 50 左右 时，加入适量的激素，然后分装。 （ 3）过滤灭菌 主要是利用 紫外灯 进行照射，适合实验室 空气、操作台等，灭菌时间 20 30min。 （ 4）射线灭菌 用火焰灼烧达到灭菌目的，适用于 接种器皿 的灭菌。 （ 5）火焰灼烧灭菌 适用 外植体、实验器皿、操作表面、皮肤 等 。几种常用消毒剂的效果比较 消 毒 剂 使用浓度 (%) 消毒时间 (min.) 效 果 残液去除 难易 乙醇 70-75 0.1-3 好 易 新洁尔灭 10 20 5 30 好 易 氯化汞 0.1 1 2 15 最好 最难 过氧化氢 10 12 5 15 较好 最易 抗生素 4 50mgl-1 30 60 较好 较难 次氯酸钙 /纳 9 10 5 30 好 易 （ 6）消毒剂 长期不用的培养室或接种室要进行熏蒸。方法： 甲 醛、高锰酸钾熏蒸。 （ 7）熏蒸灭菌 人为因素（工作人员本身）：工作服、帽、口罩（紫外）、酒 精擦手。 物品因素 器 皿 和 用 具 培养皿：洗 干热和湿热 玻璃器皿：洗 干热和湿热 接种用具： 泡 75%- 烧 干热和湿热 培养基：湿热 培 养 材 料 外部细菌：用水冲洗 消毒剂处理 内部细菌 茎尖培养 加抗生素：青霉素、利福平 操作的空气：洗刷地板 75%酒精擦超净工作台 用化学试剂薰蒸，紫外 污染来源 接种操作应在 近火焰处 进行，且动作要迅速 接种过程中尽可能达到悬空要求 防止操作带来的污染 接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口 瓶盖朝上放，接种完毕后立即盖好瓶口 培养基及其配制 培养基 (culture medium) 根据植物生长所需营养 成分，配制成的供植物生长的 人工制作的营养物质 。 是植物组织培养的重要基质。 v不同植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种 植物不同部位的组织对营养的要求也不相同 v没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器 官 一培养基成分 主要为： 水 无机盐： 大量和微量元素 有机化合物： 维生素，氨基酸 碳源和能源： 糖 生长调节物质： IAA， KT， GA3， 6-BA 培养体的支持材料 1.水 水是植物体的重要组成成分，是一切代谢过程 的 介质和溶媒 ，是生命活动过程中不可缺少的 物质。 培养基大部分是水（ 固体培养基 约 75 80%） 天然水或自来水 不能 直接用于培养基配制 原生质体培养、细胞培养及分生组织培养一般 应用 双蒸水 或 超纯水 。 保持母液及培养基成 分的精确性 防止贮藏过程发霉变 质 无机盐类 (inorganic element） 离体组织生长发育的基本成分，根据 植物对必需元素需要的量，可以分为： 大量元素 微量元素 植物体内 必要元素 大量元素 :C、 H、 O、 N、 P、 S、 K、 Ca、 Mg 微量元素 :Fe、 B、 Cu、 Zn、 Mn、 Cl、 Mo 有利元素 Co、 Na、 Se、 Si、 Ga 大量元素 指植物所需元素的浓度大于 0.5mmol L的元素，有 C、 H、 O、 N、 P、 K、 Ca、 Mg、 S。 除 C、 H、 O外，其它矿质元素通常以一定浓度的 无 机化合物 形式，按一定比例配制而成，溶于水中以 离子态被吸收 微量元素 浓度小于 0.5mmol L的元素，有 Fe、 Cu、 Zn 等。 铁盐在合成叶绿素中起重要作用，缺铁影响到 胚的发育，阻碍子叶变绿。 3.有机化合物 (organic compound) 为使培养物的生长更好，还需添加各种有机成 分： 糖类、维生素、醇类、嘌呤、氨基酸 等 （）糖类（碳水化合物 ） 碳源，维持培养基的渗透压在 1.5-4.1MPa。多使 用 蔗糖 。 不同浓度会影响细胞的增殖分化，试管苗生长与繁殖浓度 2- 3%，幼胚培养 4-6%，某些特殊培养中用 8-10%。 细胞和原生质体培养还用麦芽糖、葡萄糖、果糖 （）维生素 明显的促进 离体 培养物的 生长 。 盐酸硫胺素 -VB1、盐酸吡哆醇 -VB6、烟酸、生物素、抗坏 血酸 -Vc等。 一般用量为 0.1 1.0mg L。 （）肌醇 （环己六醇） 促进 胚状体和芽的形成 。用量一般 50-100mg/L。 （ 4）氨基酸 常用甘氨酸和多种氨基酸混合物（水解酪蛋白、水解乳蛋 白）用量在 10-1000mg L之间。 （ 营养丰富，极易引起污染 ，如在培养中无特别需要，以不用为宜。） （ 5） 天然复合物（包括部分蛋白质水解物） v 成分比较复杂 ，大多含氨基酸、激素、酶等一 些复杂化合物。 v 对细胞和 组织 的 增殖与分化 有明显的促进，但 对 器官 的分化作用不明显。 v 成分大多不清楚 ，一般尽量避免使用。 椰乳 使用最多、效果最大。用量为 10% 20%（愈伤、细胞培养） 香蕉汁 用量为 150-200ml L，缓冲 pH值（兰花组培）。 马铃薯 用量为 150 200g L，缓冲 pH值。 其他 酵母提取液、麦芽提取液、苹果和番茄的果汁等。遇热较 稳定，大多在培养困难时使用， 有时有效 。 、生长调节物质（植物激素） 植物激素（ hormone）是植物新陈代谢中产生的 天然化合物，能以 极微小的量 影响到植物的 细胞分 化、分裂、发育 ，影响到植物的 形态建成、开花、 结实、成熟、脱落、衰老 和 休眠 以及 萌发 等多种生 理生化活动，是培养基的 关键物质 。 主要包括： 生长素、细胞分裂素、赤霉素 生长素 0.05- 5mg L 细胞分裂素 0.0510mg L 。 （）生长素类 (auxin) u 生长素主要被用于 诱导愈伤 组织形成，促进细胞 脱 分化，诱导根 的分化和 促进 细胞 伸长 生长。 u天然 的生长素 热稳定性差 ，高温高压或受光条件易被破 坏。在植物体内也易受到体内酶的分解。组织培养中常 用 人工合成 的生长素类物质 u IAA（ indole-3-acetic acid ）（ 吲哚乙酸） 、 IBA（ 吲哚丁酸）、 NAA（萘乙酸）、 2,4-D u 配成 1mg/ml的溶液贮于冰箱中 v IAA-天然生长素，亦可人工合成，其 活力较低 ，是生 长素中活力最弱的激素，对器官形成的副作用小，高 温高压易被破坏，受光也易分解 v NAA-启动能力比 IAA高出 3-4倍，可大批量人工合成， 耐高温高压，不易被分解破坏，应用较 普遍 v IBA-促进 发根 能力较强 NAA和 IBA广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进 芽的增殖和生长。 v 2,4-D -启动能力比 IAA高 10倍，特别是 促进愈伤 组织 的形成，同时强烈 抑制芽 的形成，影响器官的发育。 适宜的用量范围较狭窄，过量常 有毒效应 腺嘌吟的衍生物，包括 6-BA、 Kt、 Zt 等。其中 Zt 活性最强，但非常昂贵，常用的是 6-BA。 作用： 诱导 芽 的分化 促进 侧芽 萌发生长 促进细胞 分裂与扩大（茎增粗）， 抑制根的分化， 延缓衰老 多用于诱导不定芽的分化、 芽的增殖 。 （）细胞分裂素类 (cytokinin， CTK) 激素配比模式 生长素 /细胞分裂素的比值决定分化发育的方 向，是愈伤组织、长根还是长芽。 生长素 /细胞分裂素 高 利 于 根 的形成 适中 愈伤组织 低 有利于芽的形成 （）赤霉素（ gibberellic acid） n 有 20多种，培养基中添加的是 GA3，一般极少使用 n 作用 n 打破休眠，促进种子、块茎、鳞茎等提前萌发。 n 促进幼苗 茎的伸长 生长 n 促进 胚发育 成小植株； n 离体培养下，还与 生长素 协调作用对 形成层分化 有影响 n 当 生长素 赤霉素比值 高，木质部分化 ，比值 低，韧皮部分化 。 n 在器官形成后，添加赤霉素 有时 可促进 器官或胚状体的生长 Growth medium is optimised for regeneration of plantlets No sucrose (0%) Sucrose reduced to 1% Sucrose increased to 5% The explant is completely covered with green shoots, and roots are developing on the lower surface Very few shoots have developed on the explant. No roots and no callus. Shoots developed on edges of upper surface, and some root development has occured Shoots have developed over the surface of the explant, along with roots from the lower surface. The result is comparable with the control medium tissue culture in the African Violet No 6-BA 6-BA reduced to 0.1 mg. l-1 No NAA Poor shoot development and no roots. Extensive callus generation Poor shoot development and no roots NAA reduced to 0.1 mg. l-1 More balanced development of roots and shoots. However, undifferentiated callus is developing at the edges of the explant Profuse development of roots and a reduced number of shoots. Undifferentiated callus is developing at the edges of the explant NAA increased to 5.0 mg. l-1 Profuse development of roots over the explant upper and lower surface, and few shoots. Some callus No MS salts No sign of regeneratio n from explant at all. MS salts reduced to 0.47 g. l-1 Some root growth but reduced development of shoots MS salts increased to 9.52 g. l-1 Shoots developed on upper surface of explant. No roots or callus. 其它附加成分 （） 琼脂 (agar) 是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物， 本身并不提供任何营养。 组织培养中最常用作凝 固剂，是最方便、最好的凝固剂和支持物，常用 量 6-10g L ，不是培养基必需成分。 （） 活性炭 (active carbon) 常用的吸附剂，某些培养类型中，可以吸附 培养过程中产生的一些有毒物质，有利于培养物 的生长。常用浓度 0.5%左右， 常用培养基的种类、配方及特点 、培养基种类 v 根据作用分： 诱导 培养基：诱导外植体启动生长。 增殖 培养基：诱导离体培养苗扩大繁殖。 生根 培养基：诱导离体培养苗生根。 v 根据营养水平分： 基本 培养基：包含无机盐等基本营养成分。 完全 培养基：包含使植物离体生长全面营养。 v MS培养基 （ Murashige和 Skoog） 无机盐和离子浓度较高，硝酸盐含量较其他培养基为高。 v B5培养基 含有较低的铵，双子叶植物特别是木本植物许多都适于用 B5 v White培养基 1963年又作了改良，称作 White改良培养基。无机机盐数量较 低，适于生根培养。 v N6培养基 成分较简单， KNO3和（ NH4） 2SO4含量高。广泛应用于小麦、水 稻及其他植物的花药培养和其他组织培养。 v KM8P培养基 有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛用于 原生质融合的培养。 培养基的种类 培养基的配制 、母液的配制和保存 母液是欲配制液的 浓缩液 保证各物质 成分的准确性 ， 减少微量元素用 药称量误差 配制时能 快速移取 ， 减少称药麻烦 便于低温保藏 。 一般母液配成比所需浓度高 10-100倍。 注意事项 v 浓度高耐贮存，但准确度低；浓度过低不耐贮 v 避免不恰当混合引起 沉淀 v 母液保存在 4 冰箱中，出现沉淀、霉变的不能 使用 （）大量元素 v 可以混在一起配制成 10100 倍液（常用 50倍） v 高浓度 的 Ca2+和 Mg2+会与磷酸盐混合，产生不溶 性沉淀，应单独配制 CaCl2 （）微量元素 可配成 50-1000倍（常用 100、 200倍）混合母液。 （）铁盐 硫酸亚铁 和 EDTA钠盐 易沉淀，需单独配制。 （）有机化合物 维生素、肌醇、氨基酸等一起配成 100或 200 倍液，也可分别配制。 （）激素 每种单独配成母液储于冰箱，浓度一般为 0.5 1mg/ml。一般一次只配 50ml或 100ml。 激素难溶于 水，配制母液时用 95%酒精 或 1NHCl， 1NNaOH溶解 后再定容。 生长素类用 NaOH、细胞分裂素用 HCl溶 解 、培养基的配制及灭菌 培养基配制程序：培养基配制程序： 取适量蒸馏水放入容器 将母液取出混合 将琼脂和糖加入容器 蒸馏水定容至 所需体积 调整 p 分装培养瓶 培养基的灭菌：培养基的灭菌： 湿热灭菌法，灭菌 15-20min 某些遇热不稳定的物质如 IAA、 GA3等 进行过（抽） 滤灭菌 一、外植体的选择 在植株生长的最适时期取材（花药培养在 单核期 取材 ） 大小一般在 0.5-1.0cm之间（胚胎培养或脱毒在 0.5cm 以下），材料太大易污染，材料太小难于成活。 从 生长健壮 的 无病虫害 的植株上选取 发育正常 的器官 和组织。 最好采用茎尖 ，后代性状较稳定，携带细菌 较少。 二、外植体的灭菌 外植体选取 流水冲洗 （转入超净工作台 ） 70% 酒精表面消毒 2060s 无菌水冲洗 消毒剂 处理 无菌水充分洗净 备用 三、外植体的接种（无菌操作） 外植体的接种是把经过表面灭菌后的植物材料切 碎或分离出器官、组织、细胞、转 放到无菌培养基 上 的全部操作过程。 整个过程均需无菌操作 。 （ 1）借助 接种用工具 将材料 切割 分离。 （ 2）将培养基放入超净工作台内， 火焰灼烧培 养基瓶口 ，然后打开培养瓶口，置培养瓶为 斜 角 ，避免灰尘杂菌落入瓶中。 （ 3）迅速将切割分离下的所需组织、细胞、器 官，放入培养基上，及时盖上瓶盖。 （ 4）工具用后应及时灭菌，避免 交叉污染 。 接种茎段：注意形态学下端插入培养基内，而形态学 上端露于空气中 正 确 错 误 外植体的培养 v 主要因素： 光照、温度、湿度、氧气 、光照 光照强度、光质以及光照时间，对细胞的增殖 、器官的分化都有很大影响。除特殊要求外，一般 都采用 特殊日光灯 作光源，光照强度 1000-5000Lx， 根据不同植物或器官需要，可以每天连续光照 12-16 小时，也可每天光照 16小时， 8小时黑暗。 、温度 大所数植物最适温度在 23-32 之间。培养室温度 是 252 。 、湿度 培养瓶内相对湿度常是 100%，培养室一般要求相对湿度保持在 70-80%，相对湿度 过低影响培养物生长和分化，应向室内喷洒水 ，以提高湿度；过高杂菌滋生，大量污染，应及时地通风除湿。 、氧气 接种时要有部分组织和空气接触。 振荡培养 是解决通气的良好 办法。固体培养中，如瓶塞不透气，培养物也不能生长，要选择 通气性好的培养瓶盖 ，增加可利用的氧气，迅速除去释放出来的 CO2，有利于外植体外层细胞开始分裂。 、 pH值 不同的植物对培养基最适 pH值的要求也是不同的， 大多在 5 6.5左右，一般培养基皆要求 5.8， 这基本能适应大多植物培养的 需要。 种子和分生组织：培养时通常将其贴放在培养基表 面，而不是插到培养基内部，以免供氧不足 正 确 错 误 （ 1）遗传因素 （ 2）取材部位 （ 3）生理状态 （ 4）环境条件 （ 5）预处理 （ 6）培养基 :激素，有机附加物，大量元素，糖 ，微量元素， pH值，固体液体培养基 (7)培养条件 :温度，湿度，光照（强度，长度， 品质）温差，气体 影响组培成功的因素 培养中常见问题 （ 一）一） 污染污染 病原菌 ： 细菌、真菌 细菌 污染：菌斑呈 黏液状 ，接种后 1-2天发现。 污染途径：外植体带菌；培养基及器皿灭菌不彻底 操作人员未遵守操作规程 真菌 污染： 污染部分长有不同颜色的 霉菌 ，接种后 3- 10天 发现。 污染途径：周围环境不清洁；超净工作台过滤装置 失效；培养瓶的口径过大 在组织培养过程中培养基 和培养材料滋生杂菌，导 致培养失败的现象 2、污染的预防措施 （）防止材料带菌的措施 茎尖作外植体时，进行 预培养 （无糖）或暗培养 ，以 新抽嫩枝 作外植体。 晴天 取材， 下午 取材，经日晒可杀死部分细菌或 真菌 接种时除 去外部韧皮 组织，只接内部的分生组织 。 （ 2）外植体的灭菌 多次 灭菌法：次氯酸钠 -无菌水 -次氯酸钠 多药剂 交替法：肥皂水 -酒精 -次氯酸钠 -无菌水 器皿与金属器械的灭菌 玻璃器皿可采用湿热灭菌或 干热灭菌 金属器皿一般 火焰 灭菌，也可干热灭菌 布质制品的灭菌 湿热灭菌 无菌操作室的灭菌 2%新洁尔灭或 70%酒精擦拭（喷雾），紫外灯 照射，定期甲醛和高锰酸钾熏蒸。 严格按照无菌操作程序进行 （二）（二） 褐变褐变 a. 基因型 b. 外植体的生理状态 幼年的材料、分生组织含醌类物质较少 a. 培养基的成分 无机盐浓度过高 生长调节物质使用不当， 6BA过多 培养条件不适宜， 温度过高或光照过强 b. 材料转移时间 时间过长引起材料褐变 外植体体内的多酚氧化酶被激活，使细胞 内的酚类物质氧化成棕褐色的醌类物质， 这种致死的褐变物向外扩散致使培养基逐 渐变成褐色，抑制其它酶的活性，影响外 植体的分化，最后变褐死亡的现象。 1、影响因素 选择 适宜的外植体 及 最佳培养基 提高 转管 率 加 抗氧化剂 （抗坏血酸、 PVP、牛血清白蛋白等） 加 活性炭 0.1-0.5%活性炭 2、褐变的防止措施 （三）玻璃化（三）玻璃化 （ Vitrification） l 组培苗外观形态呈 半透明状的生长异常现象 l叶、嫩梢呈水晶透明或半透明 水浸状 ；矮小 肿胀失 绿 ；叶片皱缩卷曲、 脆弱易碎 l叶表 无角质层 蜡质，没有功能性气孔，不具有栅栏 组织，仅有海绵组织 l体内 含水量高 ，干物质低， 光合能力和酶活性降低 ，组织畸形，器官功能不全， 分化能力降低 l生根困难 ，很难继续培养和移栽成活 激素 ：细胞分裂素浓度、比例过高 琼脂 ：琼脂浓度低（培养基太 “ 稀 ” ） 温度 ：高温 光照 时间：光照不足 通风 条件：气体交换不良 (6)离子 水平：无机离子种类及比例不当 主要原因主要原因 提高蔗糖和琼脂浓度（提高 渗透势 ） 适当降低细胞分裂素浓度，增加生长素比例 适当增加 Ca、 Mg、 Mn、 K、 P、 Fe、 Cu，降低 N（ 铵态 氮 ）和 Cl（ 重选或改良培养基配方 ） 增加 自然光照 ， 1000-1800lx，控制光照时间 8-12h 适温 生长 使用透气性好的封口膜 预防措施预防措施 试管苗试管苗 的驯化与移栽的驯化与移栽 一、试管苗的特点 1、试管苗的生态环境 高、恒温 v试管苗整个生长过程中采用的是 恒温培养，温 差很小 。并且温度一般控制在 25+2 甚至更高 v外界环境条件 温度不断变化 ，其调节由太阳辐 射决定， 温差很大（季节、日夜） ，而且一般 不会达到 25+2 。 组织培养出来的苗通 称试管苗或组培苗 高湿 v 瓶内相对湿度接近 100%，远远大于瓶外空气湿 度，故 试管苗蒸腾小 。 弱光 v 试管瓶内光照一般比太阳光弱，幼苗生长也较 弱，不能受太阳光直接照射。 无菌 v 试管苗所在环境无菌，与外界有菌环境不同， 试管苗也无菌，同时，培养瓶内气体环境较为 特殊，与外界环境有很大差异。 试管苗 生长细弱 、茎叶表面角质层不发达 叶绿体的 光合作用 较 差 叶片 气孔数目少 ，活性差 根 的 吸收功能差 对逆境的 适应性 和抵抗能力较 差 2、试管苗特点 试管苗的驯化 1、目的 v 提高 试管苗对外界环境条件的 适应性 ，提高光 合能力，使试管苗 健壮 ，提高试管苗 移栽成活 率 。 2、原则 v 逐步调 节 温、湿、光、无菌等环境要素，循序 渐进 3、驯化方法（炼苗） v 培养室培养 半遮荫的自然光，打开瓶 盖（无菌到有菌），注入少量自来水（逐渐降低 幼苗温度） v 一般进行 1-2周 试管苗的移栽试管苗的移栽 将试管苗从培养瓶中取出，小心操作，勿把根系损坏 。然后 洗净根部的培养基 。在盆土中开一穴，将植 株栽下，最好将根铺展开，种植不要过深，也不能 过浅，不要用手用力压土，以免造成根系的损伤。 1、壮苗移栽 2、生长素（ NAA）处理 3、降低无机盐浓度（移栽初期也不要施肥） 4、生根培养基中添加活性炭（生根多） 5、避免太阳直射，温度 25-30 ，湿度在 85%以上（ 关键在移栽后 10天） 四、提高试管苗移栽成活率的途径 移栽后管理 土壤要保持疏松，通气要好 ，这样有利于根 系的发育。 水分的控制要得当 ，移栽后第一次浇水要浇 透，且 勿出现上湿下干 现象。第一次浇水最好 采用渗水的方式，即将刚移栽的盆放在装有水 的盆中，让水从盆底逐渐渗上来，水在盆面出 现既可。平时要勤观察，保持土壤湿润。 注意天气变化 ，试管苗应移栽在无风的地方 ，移栽初期应避免大的风雨的袭击。 试管苗 炼苗 取苗 洗净琼 脂 小心移栽 苗期管理（初期 湿度要大，基质通气湿润，保湿保温 ） 第三节 植物器官的培养 外植体形成完整植株的途径 （一）外植体 -愈伤组织 -完整植株。 1、愈伤组织 -同时长芽和根 -植株。 2、愈伤组织 -芽 -根 -植株。 3、愈伤组织 -根 -芽 -植株。 （二）外植体 -胚状体 -植株。 1、器官上发生； 2、愈伤组织上发生； 3、游离单细胞发生； 4、小孢子发生。 （三）外植体 -直接形成根与芽 -植株。 外植体 愈伤组织脱分化 再分化 体细胞胚 器官发生 植株 植株 植物再生的三条途径 植物再生的类型 v 器官发生型 (organogenesis type) v 胚状体发生型 (embryogenesis type) v 器官型 (organ type) 原球茎型 球茎芽型 块茎型 鳞茎型 孢子型 根茎型 微枝扦插型 器官发生型： v 诱导器官外植体产生 愈伤组织 ，经分化培 养形成芽、根再生成植株的方式。 v 特点：繁殖速度快；培养经愈伤组织阶段再 生成植株， 对培养基要求不高 ， 遗传性不稳 定，易产生变异 。 芦荟、烟草、油菜等 胚状体发生型： v 指植物器官、组织和细胞外植体经培养脱 分化形成 胚状体 再成苗的方式。 v 特点：胚状体发生数量多、速度快、结构 完整， 对培养基要求高 ； 遗传性稳定 。 甘蔗、胡萝卜等 器官型 v 指直接从茎、叶、鳞片等外植体上 诱导不定 芽 、 根或带芽的休眠器官 （如小鳞茎、小球 茎、小块茎）产生再生成植株的方式。 v 特点： 对培养基要求高；器官发生苛刻，遗 传性稳定。 三倍体无籽西瓜、香蕉等 原球茎型 (protocorm type) v 兰属特有的方式 ，即外植体经培 养产生原球茎， 再直接长成植株 。 鳞茎型 v 鳞片近轴面或边缘直接形成带根的小鳞茎 百合 郁金香 孢子型 v 用成熟或未成熟的孢子进行培养 v 孢子繁殖最困难的是表面消毒，萌发时间较长 地钱 狼尾蕨 微枝扦插型 带芽的小插条在试管内进行无菌扦插 为 木本植物 进行快速繁殖的主要方式 葡萄、杨树 植 物 器 官 培 养 营养器官 培养 生殖器官 培养 根培养 茎培养（ 包括茎尖、茎段） 叶培养（包括叶原基、叶柄、 叶 鞘、叶片、子叶） 花培养 （包括花托、花瓣、花丝、 花柄、子房、花药） 胚胎培养（包括幼胚、成熟胚、 胚珠、 子房、胚乳培养 ） 一、离体根的培养 离体根生长要求 无机离子浓度低 的 White培养基，其他培养基如 MS