溶血性贫血的实验室检查

溶血性贫血的实验室 检查 辽宁中医药大学附属医院 高万里 l溶血性贫血的概念 l溶血性贫血的分类 l主要溶血性贫血的病因分类及常见疾病 l溶血性贫血的临床特点 l溶血的实验室检查 l溶血性贫血的常用实验室检查及意义 l血管内和血管外溶血的鉴别 溶血的概念 l溶血 ： 病理状态下，红细胞的寿命缩短， 红细胞过多、过早被破坏，称之为溶血。 l代偿性溶血： 在溶血情况下，骨髓代偿性 增生，生成红细胞的效率可以补偿过早、 过多消亡的红细胞，而不出现贫血，称之 为代偿性溶血。 l溶血性贫血： 红细胞的破坏过速、过多， 超过代偿能力所发生的贫血，称之为溶血 性贫血。 溶血性贫血的分类 l 根据溶血发生的急缓和持续时间的长短，分急 性和慢性； l 根据红细胞的破坏场所的不同，分为血管内溶 血和血管外溶血； l 常见分类法是按先天性、获得性和发病机理分 类。 1.先天性溶血性贫血 多为遗传性红细胞内在缺陷，包括膜、酶、 血红蛋白合成异常所致的溶血性贫血。 2.获得性溶血性贫血 多为红细胞外在因素异常，包括免疫因素、药 物因素、生物因素等所致的溶血性贫血。 主要溶血性贫血的病因 分类及常见疾病 l先天性溶血性贫血 l获得性溶血性贫血 先天性溶血性贫血 l 膜缺陷： 遗传性球形红细胞增多症、遗传性椭 圆 形红细胞增多症、遗传性口形红细胞增多 症 . l 酶缺陷： 葡萄糖 -6-磷酸脱氢酶缺陷症、丙酮酸 激酶缺陷症、葡萄糖磷酸异构酶缺陷症、嘧啶 -5 -核苷酸酶缺陷症 . l 珠蛋白异常： （血红蛋白分子病） 珠蛋白量的异常，如海洋性贫血等。珠蛋白质 的异常，如镰刀形红细胞贫血、血红蛋白 C、 血 红蛋白 D、 血红蛋白 E等。 获得性溶血性贫血 l 免疫因素： （存在有破坏红细胞的抗体） 自身免疫性溶血性贫血、冷凝集素综合征、阵发性冷性 血红蛋白尿、药物诱发的免疫性溶血性贫血、新生儿同 种免疫性溶血性贫血、溶血性输血反应 l 膜缺陷： 阵发性睡眠性血红蛋白尿 l 感染因素： 原虫、病毒、支原体及细菌感染等 l 化学因素： 某些化学药物及毒素，如苯肼、砷化氢、蛇 毒等 l 物理及机械因素： 大面积烧伤、心脏瓣膜异常、人工瓣 膜、血管病变、微血管溶血性贫血 l 其他： 脾功能亢进 溶血性贫血的临床特点 l急性溶血性贫血： 1.起病急骤、 2.寒战高 热、 3.头痛恶心呕吐、 4.面色苍白黄疸、 5.严重者可出现周围循环衰竭或急性肾功 能衰竭 . l慢性溶血性贫血： 1.起病缓慢病状轻微、 2.贫血黄疸肝脾肿大三联症、 3.可以并发 胆石症和肝功能损害 . 溶血的实验室检查 l检查内容 l反映红细胞破坏增生的检查 l反映红细胞寿命缩短、易于破坏的检 查 l有关红细胞代偿性增生的检查 检 查 目 的 l肯定溶血证据 l确定主要溶血部位 l寻找溶血原因 反映红细胞破坏增生的检查 l间接胆红素增高 l尿中尿胆原排泄增加 l粪便中粪胆原排泄增加 l血清结合珠蛋白降低 l血浆游离血红蛋白明显增加 l尿含铁血黄素阳性 l血红蛋白尿 l高铁血红蛋白血症 反映红细胞寿命缩短、易于破 坏的检查 l红细胞畸形、破坏红细胞增多 l单核 -巨噬细胞吞噬红细胞现象 l红细胞寿命缩短 l红细胞脆性增加 有关红细胞代偿性增生的检 查 l网织红细胞增多 l血中出现大量幼红细胞 l血中大红细胞 l骨髓中幼红细胞明显增生 溶血性贫血的常用实验室检查及 意义 l红细胞渗透脆性试验增高： 遗传性球形红 细胞增多症、椭圆形红细胞增多症 l抗人球蛋白试验阳性 : 1.自身免疫性溶血性贫血 2.药物免疫性溶血性贫血 3. 新生儿同种免疫溶血病 4.冷凝集素综合征 l酸溶血试验阳性： PNH（ 作为肯定诊断） lROUS试验阳性： PNH（ 作为筛选检查） l蔗糖溶血试验： PNH（ 作为筛选检查） l热溶血试验： PNH（ 作为筛选检查） l 高铁血红蛋白还原试验 ：还原率降低 葡萄糖 -6 -磷酸脱氢酶缺陷症 l 血红蛋白电泳异常： 常用于检查 Hbc、 HbBar等 lHbA2增高： 珠蛋白生成障碍性贫血 lHbF增高： 珠蛋白生成障碍性贫血 lHbH包涵体检查阳性： 珠蛋白生成障碍性贫血 l 异丙醇沉淀试验阳性： 提示有不稳定血红蛋白 存在 l 热变性试验 ： 沉淀率增高 存在不稳定血红蛋白 ，大于 10%有诊断意义 l 镰变性试验阳性： Hbs病 l 冷热溶血试验阳性： PCH病 血管内和血管外溶血的鉴 别 特征 血管内溶血（ 细 胞外溶血） 血管外溶血（ 细 胞内溶血） 病因 红细 胞内缺陷，外因素 获 得性多 见 红细 胞内缺陷，外因素 遗传 性多 见 RBC破坏 场所 血管内（在血循 环 中破坏） 在肝和脾的 单 核 -巨噬 细 胞内破 坏 发病特征 一般 为 急性，也可慢性 一般 为 慢性，可有急性溶血危象 贫血 较 重 较轻 ，溶血危象 时 加重 黄疸 较 明 显 可 轻 可重 血间接胆 红素 增高明 显 增高 肝脾肿大 少 见 常 见 血管内和血管外溶血的鉴 别 红细胞形态异常 可 见 常 见 红细胞脆性改变 变 化小 多有改 变 血浆血红蛋白 增高，常大于 100mg/L 轻 度增高 血红蛋白尿 常 见 无 含铁血红蛋白尿 慢性常 见 一般阴性 骨髓再障危象 少 见 急性溶血加重 时 可 见 LDH 增高 轻 度增高 溶血象检查的原理、试 剂 及操作规程 （一 ）红细胞渗透脆性试验 l实验原理 渗透脆性试验是检测红细胞对不同浓 度低渗盐溶液的抵抗力。红细胞在低渗盐 溶中，当水渗透其内部达一定程度时，红 细胞发生膨胀破裂。根据不同浓度的低渗 盐溶液中红细胞溶血的情况，反映红细胞 表面积与容积的比值，反映其对低渗盐溶 液的抵抗性。比值愈小，红细胞抵抗力愈 小，渗透脆性增加。反之抵抗力增大。 l试 剂 171mmol/LNaCl溶液（ 10g/L） 取经 100 烘干的分析纯氯化钠 0.7g置 100ml容量瓶中，加少量双蒸水溶液解后 ，再加双蒸水至刻度。 l样品要求 静脉血 4-5ml l操作程序 1. 静脉血 4-5ml放入盛 有玻璃珠的三角烧 瓶内轻轻摇动（去掉纤维蛋白），直到血 液不凝为止。将此血液放入离心管内离心 10分钟左右，去掉血浆，再用 0.9% 的 NaCl反复洗涤三次，再配成 10% RBC悬 液，分别于下列每管加一滴。表格如下： 试 管号 1 2 3 4 5 6 7 8 0.7% NaCl 1.25 1.20 1.15 1.10 1.05 1.00 0.95 0.90 蒸 馏 水 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 NaCl 浓 度（ %) 0.70 0.67 0.64 0.62 0.59 0.56 0.53 0.50 试 管号 9 10 11 12 13 14 15 16 0.7% NaCl 0.85 0.80 0.75 0.70 0.65 0.60 0.55 0.50 蒸 馏 水 0.40 0.45 0.50 0.55 0.60 0.65 0.70 0.75 NaCl浓 度（ % ） 0.48 0.45 0.42 0.39 0.36 0.33 0.30 0.27 2. 混匀、经过两小时观察 RBC始溶及全 溶 NaCl浓度 l分析结果 静置室温 2小时，从高浓度试管开始观 察，上层溶液开始出现透明红色且管底有 红细胞者为开始溶血管；溶液透明红色， 管底完全无红细胞者为完全溶血。 l参考值 正常溶血：初溶 0.42-0.46% ；全溶 0.28- 0.33 注： 本试验需有正常对照。 l临床意义 l 脆性增加 主要见于遗传性球形红细胞增多症，椭 圆形红细胞增多症和部分自身免疫性溶血 性贫血。 l 脆性降低 主要见于珠蛋白生成障碍性贫血，血红 蛋白 C、 D、 E病，低色素性贫血，肝疾病 等。 （二）抗人球蛋白试验 （ Coombs试验） l实验原理 l 抗人球蛋白试验（ Coombs试验） 检测自身免疫性溶血性贫血的自身抗体（ IgG）。 分为检测红细胞表面有无不完全抗体的 直接抗人球蛋白试验和检测血清中有无不完全 抗体的间接抗人球蛋白试验。直接抗人球蛋白 试验应用抗人球蛋白试剂（抗 IgG和 /或抗 C3d） 与红细胞表面的 IgG分子结合，如红细胞表面存 在自身抗体，出现凝集反应。间接试验应用 Rh （ D） 阳性 O型正常人红细胞与受检血清混合孵 育，如血清中存在不完全抗体，红细胞致敏， 再加入抗人球蛋白血清，可出现凝集。 l试剂 抗人球蛋白试剂 IgG l 样品要求 机械抗凝的静脉血 3ml， 用 0.9% NaCl洗 涤数次，取 RBC备用。 l 操作程序 1. 取 10支小试管，每管加入 0.85% 生理盐水 0.5ml， 取 1： 5抗人球蛋白血清 0.5ml， 加入第一 ，充分混匀，再从第一管取出混合液 0.5ml注入 第二管混匀，再取 0.5ml注入第三管，依次下去 直至第 10管，取出 0.5ml弃去，则每管的浓度为 1 ： 10， 1： 20， 1： 40， 1： 80， 1： 160， 1： 320 2. 将不同浓度的液体，分别滴一滴于玻璃板上 （用一滴管由低浓度向高浓度加） 3. 将 10% 病人 RBC分别滴加一滴于上述玻板液 滴内，同时充分混匀， 15分钟后观察结果。 l结果分析 RBC凝集为阳性（需要正常对照） l参考值 正常人直接和间接抗人球蛋白试验均为阴性 l临床意义 自身免疫性溶血性贫血，冷凝集素综合征，新 生儿同种免疫性溶血，阵发性冷性血红蛋白尿 ，药物性免疫性溶血等直接抗人球蛋白试验阳 性。 （三）酸溶血（ Hams） 试验 l实验原理 PNH患者体内存在对补体敏感的红细 胞。 Hams试验即红细胞在酸性（ PH6.4- 6.5） 的正常血清中孵育，补体被激活， PNH红细胞破坏而产生溶血，而正常人 RBC不被溶解，无溶血现象。 l试剂 1. 1/6N HCL 2. 8.5g/L NaCl溶液 l样品要求 1. 机械抗凝静脉血 5ml， 用 0.9% NaCl洗 涤 数次，取 RBC备用（需同时用同型或 O型正常人对照）。 2. 静脉血 2ml分离出血清备用 l操作程序 1. 取两支小试管分别注入患者血清 0.25ml 2. 一管加入患者 50% 的 RBC悬液 0.0125ml， 再加入 1/6 N HCL0.025ml 3. 另一管加正常人同型或者 O型者 50% 的 RBC悬液 0.0125ml， 加入 1/6 N HCL0.025ml 4. 以上两管充分混匀，加棉塞于 37 温 箱中一小时观察有无溶血现象（可离心后 观察） l参考值 正常人 阴性 l临床意义 本试验阳性主要见于 PNH， 确诊意义大。某 些自身免疫性溶血性贫血发作严重时可呈阳性 （四） 热溶血试验 l实验原理 利用患者的红细胞在其自身的血清（含 补体）中于 37 孵育后，由于葡萄糖分解 产酸使血清酸化，从而导致溶血的发生。 l样品要求 静脉血 3ml（ 分成两管） l操作程序 取静脉血 3ml， 注入两支小试管中（各 加入 1.5ml）， 倾斜放置，一管置于室温 ，另一管放 37 温箱中， 4h， 6h， 12h， 24h， 观察有无溶血现象（可离心观察） 。 l参考值 阴性 l 临床意义 阳性见于 PNH。 遗传性球形红细胞增多 症和自身免疫性溶血性贫血亦可阳性，但 阳性率比 PNH为低。本试验用于 PNH筛选 试验。 （五） 蔗糖溶血试验 l实验原理 在离子状态蛋白质结构发生某些变化， RBC与血清免疫球蛋白之间发生抗原抗体 反应，被补体包围， PNH患者 RBC由于膜 结构异常，在有补体情况下，容易破坏， 发生溶血。 l 试剂 1. 蔗糖 2. 3.8% 枸橼酸钠溶液 l样本要求 枸橼酸钠抗凝静脉血 2ml（ 3.8% 枸橼 酸钠与静脉血比为 1： 9） l操作程序 将一份枸橼酸钠全血加入 9份新鲜配制 的糖水中（即 0.5g蔗糖 +4.5ml蒸馏水 +0.5ml抗凝血，或 10% 蔗糖水 5ml+0.5ml 抗凝血），混合后，置 37 温箱中孵育 30 分钟，离心沉淀。 l结果分析 如有溶血蔗糖液为红色，即为阳性。 l参考值 正常为阴性 l临床意义 PNH患者蔗糖溶血试验为阳性或溶血 率增加，可作为 PNH的筛选试验。自身免 疫性溶血性贫血有的可为阳性，白血病、 骨髓硬化时可出现假阳性。 （六）尿含铁血黄素试 验 （ Rous试验 ） l实验原理 当血红蛋白通过肾滤过时，部分铁离子 以含铁血黄素的形式沉积于上皮细胞，并 随尿排出。尿中含铁血黄素是不稳定的铁 蛋白的聚合体，其中的高铁离子与亚铁氰 化钾作用，在酸性环境下产生普鲁士蓝色 的亚铁氰化铁沉淀。尿沉渣肾小管细胞内 外可见直径 1-3 m的兰色颗粒。 l试剂 1. 2% 亚铁氰化钾水溶液：用时新鲜配制 。 2. 3% 盐酸 l样品要求 新鲜晨尿 10ml l操作程序 1. 取新鲜尿离心沉淀，去掉上清液。 2. 取等量的 2% 的低铁氰化钾和 1/5 N HCL混合。 3. 将管（ 2）之酸性低铁氰化钾注入尿的 沉渣试管中混合，在室温中静置 10-20分 钟，离心沉淀取沉渣镜检。 l 结果分析 如有兰色颗粒则为阳性。 l参考值 正常人为阴性 l临床意义 Rous试验阳性提示慢性血管内溶血，尿中有 铁排除出。无论有无血红蛋白尿，只要存在慢 性血管内溶血如 PNH， 本试验结果即呈阳性， 并可持续数周。但在溶血初期，虽然有血红蛋 白尿，上皮细胞内尚未形成可检出的含铁血黄 素，此时本试验可呈阴性反应。 （七） 红细胞形态观察（涂 片、染色、镜检） 成熟红细胞的形态观察对诊断溶血性贫血具 有重要意义，它可为本病的诊断提供重要的线 索和根据；如遗传性球形红细胞增多症时可达 20-30% 以上，严重者可达 100% ；遗传性椭圆形 红细胞高达 50-90% ；靶形红细胞主要见于地中 海贫血和其他血红蛋白病。某些获得性贫血如 自身免疫、感染、理化和机械因素所致的溶血 性贫血，亦可因红细胞损害而出现红细胞形态 改变，其中最主要的为出现球形红细胞和红细 胞的碎裂现象。 （八）网织红细胞检验 l概述 l 网织红细胞是介于晚幼红细胞和成熟红细胞之间，尚 未完全成熟的红细胞，因网织红细胞胞质内残留有多少 不等的核糖体、核糖核酸等嗜碱性物质，用碱性染料（ 如煌焦油蓝或新亚甲蓝）进行染色后呈绿色网状结构， 故称为网织红细胞。 l 网织红细胞较成熟红细胞体积稍大，直径为 8-9.5 m ， 在瑞氏染色后的血涂中为嗜多色红细胞。 l 新鲜血液中的红细胞用核酸荧光染料染色后，在流式 细胞仪或某些以流式细胞术为原理的血细胞分析仪上计 数网织红细胞的百分比和每升血液中的绝对值。 l 在一些全自动血细胞分析仪上，还可直接测量网织红 细胞的体积，体积分布宽度，血红蛋白含量等参数。 l参考值 1. RC百分比 ：手工法 0.5-1.5% 仪量法 0.5-2.0% 2. RC绝对值 ：手工法 （ 24-84） 10 9/L 仪量法 （ 29-75） 10 9/L 3. RC成熟指数 ： 10-34 4. RC血红蛋白含量 ： 30.4-35.8Pg（ 成人 ） l临床意义 网织红细胞计数是反映红细胞系统造血旺盛 的可靠指标，临床常用相对百分比反映网织红 细胞的数量变化，但易受红细胞比容的影响。 网织红细胞绝对技术较相对百分比更为准确。 网织红细胞成熟指数（ RMI） 能反映骨髓红系 细胞造血活性，并可用于贫血的进一步分类。 网织红细胞血红蛋白含量（ CHr） 可以更早期 、灵敏的反映红细胞血红蛋白的合成，对缺铁 性贫血的早期诊断、疗效观察及功能性缺铁的 鉴别有重要意义。 1. 网织红细胞计数 l （ 1）溶血性贫血时，骨髓红系因受到缺氧及大 量红细胞破坏产物的刺激而增生，未完全成熟 的红细胞提前释放到外周血，使网织红细胞增 多，常在 5% 以上。急性溶血性贫血时，网织红 细胞可高达 50% 以上。 l （ 2）急性失血时，网织红细胞可明显增多，其 增高的幅度依赖于出血量的多少，一般在出血 后的第 2-3天达峰值，可达 5-15% ，出血 停止后 网织红细胞逐渐恢复正常，临床上可据此判断 出血是否停止。 l（ 3）缺铁性贫血及巨幼细胞贫血时，网 织红细胞可正常、轻度升高或减低，当给 予足够的铁剂或 VB12及叶酸治疗，用药 一周内网织红细胞开始上升，在 24周后达 高峰，一般增至 5% 以上，可达 10-20% 。 随后网织红细胞数量逐渐下降，红细胞及 血红蛋白则逐渐增高，这一现象称为网织 红细胞反应，可以作为贫血治疗有效的判 断指标。 l（ 4）再生障碍性贫血时，网织红细胞减 少，一般网织红细胞常低于 0.5% ，部分慢 性再障患者网织红细胞百分比可为 1% 左 右，但其绝对值计数明显减低。临床将网 织红细胞绝对值低于 15 109/L， 作为急性 再障的诊断指标。 l（ 5）骨髓病性贫血如急性白血病、淋巴 瘤、骨髓瘤患者，骨髓中肿瘤细胞大量浸 润，使红系细胞增生受到抑制，网织红细 胞数量明显减少。 2. 网织红细胞成熟指数 （ RMI ） l RMI增高时红系细胞造血应激反应的早期信 号，此时网织红细胞数量可能仍处于参考范围 内。 l 急性大出血后， 58h即可见成熟网织红细胞增 多， RMI增大，而网织红细胞数量常在 2天后才 会出现有意义的增高。 l 红细胞生成素（ EPO） 治疗后，红系造血应 激反应随之而出现， RMI升高可作为骨髓移植 后造血功能重建的一项早期观察指标。 3.网织红细胞血红蛋白含 量 （ CHr） l 缺铁性贫血的早期诊断：缺铁性贫血时， CHr明显减低 。 当体内贮存铁减低但尚未出现 贫血，即处于潜在性缺铁期时， CHr先于血红蛋 白和血清铁等减低。当 CHr的临界值（ cut- off)75% l临床意义 G-6-PD缺乏时，高铁血红蛋白的还原率 下降。中间缺乏（杂合子）为 31-74% ， 严重缺乏（半合子或纯合子） 95%, HbF2%,HbA 2为 1.0-3.1% 。 PH 8.6TEB缓冲液适合于检出 HbA、 HbA2、 HbS、 HbC、 但 HbF不易与 HbA分开， HbH与 Hb Barts不能分开和显示，应再选择其他缓冲液进 行电泳分离。 2. PH6.5 TEB缓冲液醋酸纤维膜电泳 主要用于 HbH和 Hb Barts的检出 。 HbH等电点 为 5.6，在 PH6.5TEB缓冲液中电泳时泳向阳极， Hb Barts则在点样点不动，而其余的血红蛋白 都向阴极移动。 l临床意义 1. 通过与正常人血红蛋白电泳图谱进行 比较，可发现异常血红蛋白的区带。如 HbH、 HbE、 Hb Barts、 HbS、 HbD、 HbC等异常血红蛋白的异常。 2. HbA2增多，见于 珠蛋白生成障碍性贫 血，为杂合子的重要实验室诊断指标。 HbE病时也在 HbA2区带位置出增加，但 含量很大（在 10% 以上） HbA2轻度增加 亦可见于肝病，肿瘤和某些血液病。 溶血性贫血实验室检查筛选 试验 主要临床表现： 黄疸、贫血、肝脾肿大等。 血象检查： 红细