医学课件凋亡相关基因bax在不同细胞中表达产物差异检测_1

更多医学精品 尽在医学吧 /rayshiu 凋亡相关基因 Bax 在不同细胞中表达产物差异检测 实验（ 1） 原 理 免疫细胞化学（免疫组化）是将抗原、抗体 间的免疫反应引入细胞标本，并通过对其所带有 的特殊标记物的显示，籍以对细胞内某抗原或抗 体作定性、定位以及定量检测。 亲和组织化学： 则将一些具有双价或多价结 合力的物质 (生物素 )，应用于免疫组化，使得抗 原抗体的亲和力比免疫组化高出 100万倍。其更具 高灵敏性和高特异性。 原 理 Bax 凋亡相关基因 Bcl-2家族成员 细胞损伤时其蛋白构象发生改变（寡聚化 ） 作用线粒体膜，使其膜通透性增加，释放 Cytc，细胞凋亡 原 理 本次实验以 Bax构象蛋白为抗原，用小 鼠特异性抗体（一抗）与其结合，再用生物 素标记的羊抗小鼠抗体（二抗）与前者结合 ，形成了生物素复合物。 此复合物与 SABC作用，使得检测物被 放大，最后在显色剂 DAB的作用下， Bax构象 蛋白显色（褐色）。 器材与试剂 仪 器：移液 枪 、 枪头 、滴管、 显 微 镜 材料：培养 细 胞 试剂：甲醇、 PBS、封闭液、一 抗、 二抗、 SABC、 DAB 、 0.3 H2O2-PBS、 试 剂 说 明 PBS： 磷酸盐缓冲液（ 0.01M pH7.4 ） 封闭液： 山羊血清 (或 BSA)，用时 PBS稀释 一 抗： 小鼠 IgG，用时 PBS稀释 二抗： 生物素标记的羊抗小鼠 IgG 0.3 H2O2-PBS（甲醇） 消除内源性过氧化物酶活性作用 SABC (avidin-biotin-peroxidase complex 链酶亲和素 生物素 过氧化物酶复合物 ) ： 抗生物素，起到放大作用 DAB(diaminobenzidine)显色液： 3,3-二氨基 联 苯胺 实验步骤 培养细胞（ 96孔板，每组 3正常、 3损伤、 3损伤恢复 ） PBS 洗 3次 (轻轻 地 摇动 洗 涤 ) 甲醇固定 10min PBS 洗 3次 (轻轻 地洗 涤 ) 加入封 闭 液（ 1:10） 25l， 37 ， 30min以上 加一抗（ 1:300） 25l， 37 ， 1h以上 (或 4 过夜 ) PBS 洗 3次 (轻轻 地 摇动 洗 涤 ) 加二抗（ 1ml PBS加入生物素化山羊抗小鼠 IgG 10l ） 25l， 37 ， 1h以上 PBS 洗 3次 (轻轻 地 摇动 洗 涤 ) 实验步骤 加 0.3 H2O2-PBS/甲醇， 37 ， 30min PBS 洗 3次 (轻轻 地 摇动 洗 涤 ) SABC工作液（ 1ml PBS加入 SABC 10l，混匀） 20 -30l， 37 ， 30分钟 PBS 洗 3次 (轻轻 地 摇动 洗 涤 ) DAB显色： DAB显色工作液配制（现配）： 1ml蒸馏水，加试 剂盒中 A、 B、 C试剂各 50ul，混匀后加至细胞孔 板，镜下控制，以蒸馏水终止反应。 观察结果 实验结果 缺糖前 Hela 细胞 缺糖 24h Hela细胞 缺糖 48h Hela 细胞 缺糖前 PC 12细胞 缺糖 24 h PC 12细胞 缺糖 48 h PC 12细胞 注意事项 一、二抗的稀释度、孵育时间和温度与染色强度 、背景有直接关系。 染色背景过高，在 DAB显色之前，用含 0.01- 0.02 TWEEN20的 PBS洗涤标本 4次，再 PBS 洗 2次，然后 DAB显色。 DAB有毒性（小心） SABC试剂盒保存在 4 为佳 (2年 )，而 -20 短期 内生物活性则被破坏 。 购试剂盒时注意厂家批号