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第七章 . 微 生物的遗传与变异 Chap 7 microbial heredity and variation 四个基本概念 1、 遗传型 ( genotype): 又称基因型 指某一生物个体所含有的全部遗传因子即基因组所携带的 遗传信息。 2、 表型 (phenotype): 指某一生物个体所具有的一切外表特征和内在特性的总和 ,是其遗传型在合适环境条件下通过代谢和发育而得到的具体 体现。 代谢,发育 遗传型 + 环境条件 表型 (可能性) (现实性) 3、 变异 (variation): 指生物个体在某种外因或内因的作用下所引起的 遗传物质 结构或数量的改变,即遗传型的改变。 特点:出现几率低、性状变化幅度大、新性状稳定、可遗传。 4、 饰变 (modification): 指外表的修饰性改变,意即一种不涉及遗传物质结构改变 而只发生在转录、转译水平上的表型变化。 特点:出现几率高、性状变化幅度小、不可遗传。 n 遗传和变异是一切生物最本质的属性之一。 第一节 遗传变异的物质基础 n 遗传变异的物质基础的认识过程: 达尔文时代: “ 泛生论 ” 。血里找不到微粒。 孟德尔时代:基因,合子中成对。 (1866) 上世纪初 40 年代:染色体与基因行为一致,由核酸 和蛋白质组成,最初认为是蛋白质。 1944年后:利用微生物进行的三个著名实验,才证实 核酸( DNA) 是遗传变异的物质基础。 一、三个经典实验 一)、经典转化实验(分四步) 1、动物实验 2、 细菌培养实验 :平板培养 1)热死 S菌:不长; 2)活 R菌:长 R菌; 3)热死 S菌 +活 R菌:长大量 R菌,少量( 10-6) S菌。 3、 S菌的无细胞抽提液实验 : S菌的无细胞抽提液 +活 R菌,平板培养:长大量 R菌,少量 S 菌。 4、 S菌各细胞成分的转化实验 :(六组) 活 R菌 + S菌成分,平板培养。( 1944年) 一)经典转化实验(分四步) S菌各细胞成分的转化实验 S cell extract +DNase+ R cell R colonies 二)、噬菌体感染实验(两组)( 1952年) A. D. Hershey和 M. Chase, 1952年 ( 1)含 32P-DNA的一组:放射性 85% 在沉淀中 10分钟后 用捣碎器 使空壳脱离 吸附 离心 沉淀细胞进一步培 养后,可产生大量 完整的子代噬菌体 上清液中含 15% 放射性 沉淀中含 85% 放射性 沉淀中含 25% 放射性 以 35S标记蛋白质外壳做噬菌体感染实验 ( 2)含 35S-蛋白质的一组:放射性 75%在上清液中 10分钟后 用捣碎器 使空壳脱离 吸附 离心 沉淀细胞进一步培 养后,可产生大量 完整的子代噬菌体 上清液中含 75% 放射性 三、植物病毒的重建实验 二、遗传物质在微生物细胞内 存在的部位和方式 (一) 7个水平 1、 细胞水平 :有单核和多核; DNA集中在核(拟核)中。 2、 细胞核水平 :真核有膜,与组蛋白组成染色体;原核无膜。 3、 染色体水平 :真核生物有不同染色体数目。 单倍体:大多 数微生物、动植物生殖细胞; 双倍体:动植物体细胞、少数微生物营养细胞、合子; 部分双倍体:原核生物。 4、 核酸水平 :一般 DNA, 极少数 RNA; 一般双链,极少单链。 5、 基因水平 :每个基因约含 1000碱基对;原核生物:操纵子。 6、 密码子水平 :三联密码子 mRNA上的三个核苷酸顺序。 7、 核苷酸水平 :碱基水平,最低突变或交换单位。少数含稀有碱基。 细菌染色体 DNA的大小和结构 真核生物的染色体结构 (二)原核生物的质粒 n 质粒:游离于原核生物核基因组以外,具有独立复制 能力的小型共价闭合环状的 dsDNA分子,即 cccDNA 。 1.特点 : 形态上 :具有超螺旋结构,分子量在 106-108Da间。 遗传上 :携带有核质体上所没有的基因,使微生物具有一些非生 存必需的特殊功能。可自主复制,也可转移;可消除,也可整合 和脱离。 n 按其复制行为与核染色体的复制是否同步,分严紧型复制控制( stringent replication control)和松弛型复制控制( relaxed replication control) 。 2.质粒在基因工程 应用中 的操作优点 : 1)、体积小,便于 DNA的分离和操作; 2)、呈环状,使其在化学分离过程中能保持性能稳定; 3)、有不受核基因组控制的独立复制起始点; 4)、拷贝数多,使外源 DNA可很快扩增; 5)、存在抗药性基因等选择性标记,便于含质粒克隆的检出 和选择。 3.分离与鉴定 : 细胞裂解;与蛋白质、 RNA、 核质体 DNA等分离;鉴定(电泳、电镜、离心)。 4.种类 : 五类。(表 7-4) 典型质粒 1、 F质粒 : F因子,致育因子,性因子。 2、 R质粒 : R因子,抗性质粒。由 RTF质粒和抗性决定质 粒两片段结合形成。 3、 Col质粒 :产大肠杆菌素因子。 4、 Ti质粒 :诱癌质粒。引起双子叶植物根癌。 5、 Ri质粒 :与 Ti质粒相似,诱生毛状根。 6、 mega质粒 :巨大质粒。含一系列固 N基因。 7、 降解性质粒 :只在假单胞菌中发现。 第二节 基因突变和诱变育种 一、 基因突变 ( gene mutation) 基因突变简称突变,是变异的一类,泛指细胞内 (或病毒粒内)遗传物质的分子结构或数量突然发生 的可遗传的变化,可自发或诱导产生。突变的几率一 般很低( 10-6 10-9) 从自然界分离到的菌株一般称野生型菌株( wild type strain) ,简称野生型。野生型经突变后形成的 带有新性状的菌株,称突变株( mutant, 或突变体、 突变型)。 凡能用选择性培养基(或其他选择性培养条件) 快速选择出来的突变株称选择性突变株( selectable mutant) ,反之则称为非选择性突变株。 (一)突变类型 1、营养缺陷型 ( auxotroph) 某一野生菌株因发生基因突变而丧失合成一种或几种生长 因子、碱基或氨基酸的能力,因而无法再在基本培养基上正常 生长繁殖的变异类型。 2、 抗性突变型 ( resistant mutant) 指野生型菌株因发生基因突变,而产生的对某化学药物或 致死物理因子的抗性突变类型。 3、条件致死突变型 (conditional lethal mutant) 某菌株或病毒经基因突变后,在某种条件下可正常地生长 、繁殖并呈现其固有的表型,而在另一种条件下却无法生长、 繁殖的突变类型。 4、形态突变型 (morphological mutant) 指由突变引起的个体或菌落形态的变异,一般属非选择性 突变。 5、抗原突变型 (antigenic mutant) 指由于基因突变引起的细胞抗原结构发生的变异类型,包 括细胞壁缺陷变异、荚膜或鞭毛成分变异等。 6、产量突变型 (metabolic quantitative mutant) 通过基因突变而产生的在代谢产物产量上明显有别于原始 菌株的突变株,称产量突变型。有两种类型:正变株( plus- mutant)、 负变株( minus-mutant) (二) 突变率 ( mutation rate) 某一细胞(或病毒粒)在每一世代中发生某一性 状突变的几率,称突变率。 (三) 基因突变的特点 1.自 发 性 :各种突变都可在无人为诱变因素处理下自发发生; 2.不对应性 :突变的性状与引起的原因间无直接对应关系; 3.稀 有 性 :自发突变的几率极低,一般 10-6-10-9,但稳定; 4.独 立 性 :某一突变既不提高也不降低其他任何基因的突变率; 5.可 诱变性 :诱变剂可提高突变的几率,两种变异株无本质差别; 6.稳 定 性 :是遗传物质结构上发生了稳定的变化,稳定,可遗传; 7.可 逆 性 :任何性状都可发生正向突变,也都可发生回复突变。 (四)基因突变自发性和不对应性的实验证明 1、 Luria 等的变量试验 ( fluctuation test) 2、 Newcombe的涂布试验 3、 Lederberg等的影印平板培养法 (replica plating) (五 )基因突变及机制 1、 诱发突变 ( induced mutation ) 诱发突变简称诱变,是指通过人为的方法 ,利用物理、化学或生物因素显著提高基因自 发突变频率的手段。凡具有诱变效应的任何因 素,都称诱变剂( mutagen)。 1) 碱基的置换 ( substitution ) 转换 (嘌呤间或嘧啶间 ) 颠换 (嘌呤和嘧啶间 ) 亚硝酸引起的使 A T转换成 GC 过程的简式见下图 HNO2 A:T He:T Hk+T 第一次复制 AT HkC 第二次复制 GC HkC 直接引起置换的诱变剂 间接引起置换的诱变剂 2) 移码突变( frame-shift mutation) 指诱变剂会使 DNA序列中的一个或少数几个核苷酸发生增 添(插入)或缺失,从而使该处后面的全部遗传密码的阅读框 架发生改变,并进一步引起转录和转译错误的一类突变。 诱变剂: ICR(美国一癌症研究所名称)类化合物: 原黄素,吖啶黄,吖啶橙等。 诱变机理:至今不清。 结果:加 3、减 3;加(减) 1,短距离减(加) 1;影响小。 增(减) 1、 2、 4、 5引起后面全变。 常见的致变剂及其致变作用 (a)亚硝基的脱氨作用; (b) 烷化剂和被甲基化的碱基; (c) 5-溴脱氧嘧啶与鸟嘌呤配对 (A=T变 G三 C)。 3) 染色体畸变 ( chromosomal aberration) n 某些强烈理化因子会引起 DNA分子的大损伤( macrolesion) 染色体畸变 。 既包括染色体结构上的缺失( deletion)、 重复 (duplication)、 插入 (insertion)、 易位 (translocation)和倒位 (inversion), 也包括染色体数目的变化。 n 转座(因)子 :在染色体组中或染色体组间能改变自身 位置的一段 DNA顺序。 其跳跃过程往往导致 DNA链的断裂或重接,产生重组交换、基 因启动或关闭,使突变发生。 n 转座(因)子主要有三类: IS、 Tn、 Mu。 2、自发突变 n 自发突变 ( spontaneous mutation) 是指生物体在无人工干预下自然发生的低频率 突变。 n 自发突变的原因 : 1)背景辐射和环境因素的诱变; 2)微生物自身有害代谢产物的诱变效应; 3)互变异构效应;(配对错误) 4)环出效应。(发生缺失) (六 )紫外线对 DNA的损伤及其修复 嘧啶碱基受紫外辐射后产生的衍生物 (六 )紫外线对 DNA的损伤及其修复 1、 光复活作用 ( photoreactivation) 把经 UV照射后的微生物立即暴露于可见光下时,就可 出现明显降低其死亡率的现象,此即光复活作用。 2、 切除修复 ( excision repair) 是活细胞内一种用于对被 UV等诱变剂损伤后 DNA的修复 方式之一,又称暗修复( dark repair), 这是一种不依赖 可见光,只通过酶切作用去除嘧啶二聚体,随后重新合成 一段正常 DNA链的核酸修复方式。 (一) 自发突变与育种 1、从生产中育种 如:抗噬菌体感染, “上酒白种 ” 2、定向培育优良菌株( “驯化 ”) 如:炭疽活菌疫苗,卡介苗 (二) 诱变育种 诱变育种是指利用物理、化学等诱变剂处理均匀而分散的微生 物细胞群,在促进其突变率显著提高的基础上,采用简便、快速 和高效的筛选方法,从中挑选出少数符合育种目的的突变株,以 供科学实验或生产实践使用。 二、突变与育种 1、 诱变育种的基本环节 1)选择简便有效的诱变剂 2)挑选优良的出发菌株( original strain) 3) 处理单细胞或单孢子悬液 4)选用最适的诱变剂量 5)充分利用复合处理的协同效应( synergism) 6) 利用和创造形态、生理与产量间的相关指标 7)设计高效筛选方案(筛选比诱变更重要) 8)创造新型筛选方法 2、诱变育种中的几个原则 1)产量突变株的筛选 如:琼脂块培养法 2)营养缺陷型突变株的筛选 与筛选营养缺陷型突变株有关的 3类培养基 基本培养基、完全培养基、补充培养基 与筛选营养缺陷型突变株有关的 3类遗传个体 野生型 (A+B+) 、营养缺陷型 (A+B-)、原养型 (A+B+) 营养缺陷型突变株的应用 基本理论 :代谢途径、基因重组规律的标记菌种。 应用研究 :生产核苷酸、氨基酸,工程菌株的亲本。 3、 三类突变株的筛选方法 第一步:诱变剂处理 第二步:淘汰野生型 抗生素法(细菌)、菌丝过滤法(真菌) 第三步:检出缺陷型 夹层培养法、限量补充培养法(观大小) 逐个检出法(两种培养基)、影印平板法 第四步:鉴定缺陷型 生长谱法( auxanography) 营养缺陷型的筛选方法 3)抗药性突变株的筛选 梯度平板法 : 如:选育抗异烟肼的吡哆醇高产菌株 突变株 : 产生了可分解异烟肼的酶; 能合成更高浓度的吡哆醇(多) 获突变酵母的吡哆醇产量提高倍 方法 : 10mL普通培养基 斜放 凝固 平放 10mL药物培养基 凝固 涂诱变酵母 选厚药区菌落 检验 第三节、基因重组和杂交育种 两个独立基因组内的遗传基因,通过一定的途径转移到 一起,经过遗传分子间的重新组合,形成新的稳定基因组的过 程,称为基因重组( gene recombination) 或遗传重组 (geneic recombination), 简称重组。 n 基因重组 是在核酸分子水平上的一个概念,是遗传物质在分 子水平上的杂交。 n 基因重组 是杂交育种的理论基础。 n 杂交育种 在方向性、自觉性方面均比诱变进了一步。 n 杂交育种 可消除一菌株长期诱产量变难提高的障碍。 一、原核生物的基因重组 (一) 转化 ( transformation) 1、 定义 : 受体菌直接吸收供体菌的 DNA片段而获得后者部分遗传性 状的现象,称为转化作用。通过转化方式而形成的杂交后代, 称转化子( transformant)。 2、 感受态 ( competence) 感受态是指受体细胞最易接受外源 DNA片段并能实现转化 的一种生理状态。 n 感受态因子 :胞外蛋白,膜上一组成,催化 DNA吸收。降解某成 分,使受体露出。 3.转化因子 :离体的 DNA片段,平均约含 15 个基因。可是 dsDNA、 ssDNA, 也可是质粒 DNA( 不重组,频率最 高)。 4.出现范围 :原核生 物中较普遍;放线菌 、蓝细菌、真核微生 物中也有。 5.转化过程 : 6.转染 :用提纯的病 毒核酸感染宿主,产 生正常病毒后代。 (二)转导( transduction) n 通过缺陷噬菌体的媒介,把供体细胞的小片段 DNA携带 到受体细胞中,通过交换与整合,使后者获得前者部 分遗传性状的现象,称为转导。由转导作用而获得部 分新性状的重组细胞,称为转导子( tranductant)。 1.普遍转导 ( generalized transduction) 通过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌基因组上任 何小片段 DNA进行 “ 误包 ” ,而将其遗传性状传递给受 体菌的现象,称为普遍转导。 1) 完全普遍转导 2) 流产普遍转导 2.局限转导( restricted ransduction) n 指通过 部分缺陷 的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到 受体细胞中,并与后者的基因组整合、重组,形成转导子的现 象。 n 低频转导 ( LFT): 溶源菌的前噬菌体 “ 误切 ” 并 “ 误包 ” 的缺陷噬菌体( 10-4-10-6) ,感染可形成局限转导子。转导子 失去溶源化能力、免疫力。 n 高频转导 ( HFT): 用高感染复数 (m.o.i.) 的 LFT裂解物去 感染受体菌,可获双重溶源菌;其诱导可产高频转导裂解物; 再用低 m.o.i. 的它去感染另一受体菌,可高频率地( 50%)把 受体菌转导成转导子。 大肠杆菌 l噬菌体介导的转导 (a) 普遍性转导 (b) 局限性转导 普遍性转导与局限性转导的异同 相同点:均以噬菌体为媒介,导致遗传物质的转移。 不同点: 普 通 性 转 导 局 限 性 转 导 1)能够转导的基因: 供体菌的几乎任何基因 供体菌的少数基因 。 2)噬菌体的位置: 不整合到寄主染色体上。 整合到寄主染色体上 。 3)转导噬菌体的获得:可通过裂解反应得到。 只能通过诱导溶源菌得到 。 4)转导子的性质: 属非溶源型,转导的 属缺陷溶源型,转导 物质主要是供体菌的 的物质有供体的 DNA DNA。 和噬菌体 DNA。 3.溶源转变 ( lysogenic conversion) 当正常的温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶源 化时,因噬菌体基因整合到宿主的核基因组上,而使 宿主获得了除免疫性外的新遗传性状的现象,称为溶 源转变。 与转导的不同 : 1)是噬菌体基因,不是供体菌基因; 2)噬菌体不缺陷; 3)不形成转导子; 4)噬菌体消失,新性状同时消失。 (三)接合 ( conjugation,mating) 1、 定义 供体菌 (“ 雄性 ”) 通过性菌毛与受体菌 (“ 雌性 ”) 直接接触,把 F质粒或其携带的不 同长度的核基因组片段传递给后者,使后者 获得若干新遗传性状的现象,称为接合。 通过接合获得新遗传性状的受体细胞, 称为接合子( conjugant)。 2、 E.coli的 4种接合型菌株 1) F+菌株即雄性菌株,指细胞内存在一至几个游离态 F 质粒,并在细胞表面着生一至几条性菌毛的菌株。 2) F-菌株即雌性菌株,指细胞中无 F质粒,细胞表面也 无性菌毛的菌株。 3) Hfr菌株即高频重组菌株。 F质粒为整合态。 4) F, 菌株:当 Hfr菌株细胞内的 F质粒因不正常切离而 脱离核染色体组时,可重新形成游离的、但携带整 合位点邻近一小段核染色体基因的特殊 F质粒,称 F 质粒或 F 因子。 F质粒的整合 (四)原生质体融合( protoplast fusion) 通过人为的方法,使遗传性状不同的两个细胞的 原生质体进行融合,借以获得兼有双亲遗传性状的稳 定重组子的过程,称为原生质体融合。由此法获得的 重组子,称为融合子 (fusant)。 n 种类 :细菌、放线菌、酵母、霉菌;动植物细胞。 n 范围 :菌株间,种间;属间,科间;或更远缘。 n 重组频率 :很高,有些已大于 10-1。(诱变 10-6) n 操作步骤 : 二、真核微生物的基因重组 杂交 :指在细胞水平上进行的一种遗传重组方式。 真核微生物的主要 基因重组 方式: 有性杂交: 两性细胞间发生的接合和随之进行的染色体重组; 准性杂交: 同种而不同菌株的体细胞间发生的融合,导致低 频率基因重组; 原生质体融合: 人为的方法,使遗传性状不同的两个细胞的 原生质体进行融合; 遗传转化: 受体菌直接吸收供体菌的 DNA片段而获得后者部 分遗传性状。 一) 有性杂交 ( sexual hybridization) 一般指不同遗传型的两性细胞间发生的接合和 随之进行的染色体重组,进而产生新遗传型后代的 一种育种技术。 操作步骤 : (以酿酒酵母为例 ) 1.产子囊及孢子 :甲、乙亲本产孢子培养基培养; 2.单倍体菌落 :水洗,破坏子囊,离心,涂平板; 3.双倍体有性杂交后代 :不同性别单倍体密集接触; 4.筛选 :找出双倍体;选出优良性状的个体。 二)准性杂交 (parasexual hybridization) 准性生殖 :是一种在同种而不同菌株的体细胞间发生 的融合,它可不借减数分裂而导致低频率基因重组 并产生重组子。 (自发的原生质体融合现象 ) 1.准性生殖过程 : 1)菌丝联结; 2)形成异核体; 3)核融合或核配; (10-5-10-7) 4)体细胞交换和单倍体化,形成单倍体杂合子。 准性生殖与有性生殖的比较 1)选择亲本; 2)强制异合; 3)移单菌落; 4)检验稳定性; 5)促进变异。 2.准性杂交育种 : 第四节 基因工程 一、 基因工程定义 基因工程( gene engineering) 又称遗传工程 (genetic engineering), 是指人们利用分子生物学 的理论和技术,自觉设计、操纵、改造和重建细胞的 遗传核心 基因组,从而使生物体的遗传性状发生定 向变异,以最大限度地满足人类活动的需要。 这是一种自觉的、可人为操纵的体外 DNA重组技 术,是一种可达到超远缘杂交的育种技术,更是一种 前景宽广、正在迅速发展的定向育种新技术。 二、基因工程的特点 .目的性:随机 有目的 .体外性:突变 体外重组(切割、拼接) .时效
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