蛋白组学概论ppt课件

蛋白组学概况 1 1.蛋白质组学的概念及发展史 2 蛋白质组 (proteome)是澳大利亚学者 Williams和 Wilkins于 1994年首先提出，源于蛋白质 (protein) 与基因组 (genome)两个词的杂合，即 ”一个细胞或 一个组织基因组所表达的全部蛋白质 “。 蛋白质组对应于基因组的所有蛋白质构成的整体， 不是局限于一个或几个蛋白质。 在不同细胞、不同组织中，同一基因组的表达情况 各不相同 。 蛋白质组在空间和时间上是动态变化着的整体。 蛋白质组 (Proteome) 3 蛋白质组的概念与基因组的概念有许多差别 ，它随着组织、甚至环境状态的不同而改变 。 在转录时，一个基因可以多种 mRNA形式剪 接，并且同一蛋白可能以许多形式进行翻译 后修饰。 故 一个蛋白组不是一个基因组的直接产物 ， 蛋白质组中蛋白质的数目有时可以超过基因 组的数目。 蛋白质组 (Proteome) 4 5 6 蛋白质组学 (proteomics) 指应用各种技术手段来研究蛋白质组的 一门科学，其目的是 从整体的角度分析 细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表 达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的 相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细 胞生命活动之间的规律。 7 蛋白质组学研究内容 蛋白质组表达模式的研究： 了解 不同状态 下细胞与组织的蛋 白质组分的变化； 蛋白质组功能模式的研究： 明确各种蛋白质分子之间如何相 互作用。 功能蛋白质组 ：细胞在一定阶段或与某一生理现象相关的所 有蛋白质。介于对个别蛋白质的传统蛋白质化学研究和以全 部蛋白质为研究对象的蛋白质组学之间。 从局部入手研究蛋 白质组的各个功能亚群体。将多个亚群体组合起来，逐步描 绘出接近于生命细胞的 “全部蛋白质 ”的蛋白质组图谱。 8 蛋白质组学 产生的背景 u 基因组时代 后基因组时代 研究重点的转移 u 结构基因组学 功能基因组学 蛋白质组学是核心内容 9 10 各国政府支持，国际著名研究和商业机构加盟 ： 1996年澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质 组学研究中心 (Australia Proteome Analysis Facility, APAF) 发展 11 美国国立癌症研究院 (NCI) 投资 1000万美元建立 肺、直肠、乳腺、卵巢肿瘤的蛋白质组数据库。 NCI和 FDA共同投资数百万美元建立癌症不同阶段 的蛋白质组数据库。 英国建立三个蛋白质组研究中心对已完成或即将完 成全基因组测序的生物体进行蛋白质组研究。 发展 12 1997年召开了第一次国际 “蛋白质组学 ”会 议 1998年在美国旧金山召开了第二届国际蛋 白质组学会议 1999年 1月在英国伦敦举行了应用蛋白质组 会议 发展 13 我国也于 1998年启动了蛋白质组学研究，在中科院上海生物化学研究所 举办了两次全国性的蛋白质组学研讨会 。 2001年，中科院贺福初院士作为首席科学家，在全国范围内组织起一支 研究队伍，提出了 “人类重大疾病的蛋白质组学研究 ”973建议书并通过评 审，并确立了 9个相关课题组。 2003成立了中国人类蛋白质组组织 (CHHUPO)，并分别于 2003年 9月、 2004年 8月以及 2005年 8月召开了中国蛋白质组学首届、第二届及第三 届学术大会， 2004年 10月在中国北京召开了第三届国际蛋白质组学会议 。 科技部已将疾病蛋白质组研究列入我国 “973”计划项目和 “863”计划项目 ; 国家自然科学基金委员会也将 “蛋白质组研究 ”列为重点项目。 我国已在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白质组研究方面取得了较大的 进展。 发展 14 2003年 12月 15日，国际人类蛋白质组计划 (HPP)正式启动 。首先开始执行人类血浆蛋白质组计划 (HPPP)和人类肝脏 蛋白质组计划 (HLPP)两大先导项目。其中人类肝脏蛋白质 组计划总部设在北京，由中国担当领导国，由中国科学家领 衔组织。 两谱三图三库 ： “两谱 ”即人类肝脏蛋白质组的表达谱和修 饰谱， “三图 ”是指人类肝脏蛋白质组的定位图、连锁图和结 构图， “三库 ”即为人类肝脏蛋白质组的样本库、抗体库和数 据库。 2009年北京蛋白质组研究中心在顶级刊物 分子与细胞蛋 白质组学 同期刊发三篇论文 。 发展 15 2. 蛋白质组学研究方法概述 16 蛋白质组研究较基因组学研究更为复 杂和困难： 蛋白质数目大大超过基因的数目。 蛋白质随时间和空间而变化。 17 发展高通量、高灵敏度、高准确性 的研究技术平台是现在乃至相当一 段时间内蛋白质组学研究中的主要 任务。 当前主要任务 18 2.1 蛋白质组表达模式的 研究方法 19 蛋白质组表达模式 （ expression profile） 研究蛋白质组的组成成分 支撑技术主要有 双向凝胶电泳 、以 质 谱为代表的蛋白质鉴定技术 及 生物信 息学 分析。 20 （一）蛋白质组研究中的样品制备 通常可采用细胞或组织中的全蛋白质组 分进行蛋白质组分析。 也可进行样品预分级，即将细胞或组织 中的全体蛋白质分成不同部分，分别进 行研究。 21 样品预分级的主要方法 蛋白质溶解性 ：可溶性蛋白、非可溶性蛋 白等 蛋白质定位 ：膜蛋白、核蛋白等 蛋白质细胞器定位 ：线粒体、叶绿体、高 尔基体、过氧化物酶体等 样品预分级主要作用在于提高低丰度蛋 白质的上样量和检测灵敏度 。 22 组织水平上的蛋白质组样品制备 临床样本都是各种细胞或组织混杂，而且状 态不一，如肿瘤中癌变的上皮类细胞总是与 血管、基质细胞等混杂。 利用激光切割直接在显微镜下从组织切片中 精确分离特定的细胞或细胞群，从根本上解 决细胞异质性问题 。 主要考虑怎样提高样品收集的特异性 23 24 25 26 （二）蛋白质组研究中的样品分离 双向凝胶电泳 (two-dimensional electrophoresis， 2-DE)：利用 蛋白 质的等电点 和 分子量 ，结合凝胶化学 特性，分离各种蛋白质的方法。 27 2-DE 原 理 第一向在高压电场下对蛋白质进行 等电聚 焦电泳 (IEF), 再在第一向垂直方向上进行 第二向 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS- PAGE)。 28 29 特 点 可分离 10 100 kD分子量的蛋白质 高灵敏度和高分辨率 便于计算机进行图像分析处理 与质谱分析匹配 30 第一向 IEF电泳 传统 OFarrell系统双向电泳的缺陷。 Bjellgvist等发展并完善了固相 pH梯 度等电聚焦技术， Grg等成功地将 之应用于双向电泳。 31 固相 pH梯度等电聚焦的优点 克服了载体两性电解质阴极漂移等缺点 。 稳定的可以随意精确设定的 pH梯度。 尤其可在较窄的 pH范围内进行第二轮分析 ，大大提高了分辨率及重复性。 32 33 第二向 SDS-PAGE电泳 垂直板电泳 水平超薄胶电泳 34 35 2-DE技术的缺点 极酸、极碱性蛋白质，疏水性蛋白质，极 大蛋白质、极小蛋白质以及低丰度蛋白质 用此种技术难于有效分离。 胶内酶解过程费时、费力，难于与质谱联 用实现自动化。 36 新型非凝胶技术 液相色谱法 liquid chromatography， LC 毛细管电泳 capillary electrophoresis， CE 37 液相色谱 -质谱联用技术 (liquid chromatography/mass spectrometry, LC/MS) 简称液质联用技术。蛋白质混合物直接通 过液相色谱分离以代替 2-DE的分离，然后 进入 MS系统获得肽段分子量，再通过串联 MS技术，得到部分序列信息，最后通过计 算机联网查询、鉴定蛋白质。 38 39 多维液相色谱技术 （ LC/LC-MS/MS） 多维蛋白质鉴定技术 (multidimensional protein identification technology, MudPIT) 最常用的是离子交换色谱 -反相液相色谱联用 把不同分离模式的色谱柱串联在一根色谱柱中， 对蛋白质进行分离的定性定量技术。 40 41 42 （三）蛋白质组研究中的样品分析鉴定 传统方法：蛋白质微量测序 氨基酸组成分析 43 新型蛋白质鉴定技术 质谱（ MS）法 基本原理 ：蛋白质分子离子化后，根据离 子间质量与电荷比值（ m/z）的差异来分离 并确定样品的分子量。 一台质谱仪一般有进样装置、 离子化源 、 质量分析器、离子检测器和数据分析系统组 成。 44 电喷雾电离质谱 (Electrospray ionization mass spectrometry， ESI-MS) 主要质谱类型 待测分子溶解在溶剂中，以液相方式通过毛细管到达喷口 ；在喷口高电压作用下形成带电荷的液滴，随着液滴中溶 剂蒸发，液滴表面的电场随半径减少而增加，到达某一临 界点时，发生液滴的 “ 爆裂 ” ，重复此过程，最终产生分 子离子。 45 46 “ 软电离 ” 的特点 分子电离时保留整个分子的完整性，不 会形成碎片离子。 灵敏度高、快速、能 同时提供样品的精 确分子量和结构信息、既可定性又可定 量、并能有效地与各种色谱联用来分析 复杂体系 。 47 48 基质辅助激光解吸 /电离飞行时间质谱 基质辅助激光解吸电离离子化（ MALDI）： 样品包埋在固 体基质中，基质吸收激光而蒸发，携带部分样品分子进入气 相，将部分能量传递给样品分子使其离子化。 飞行时间质量分析器（ TOF）： 离子在电场作用下加速飞过 飞行管道，根据 到达检测器的飞行时间 不同而被检测（离子 的质荷比与离子的飞行时间成正比 ）。 （ matrix-assisted laser desorption /ionization time of flight mass spectrometry， MALDI-TOF MS） 49 50 51 鉴定蛋白质的方法 肽质量指纹图谱法 （ peptide mass fingerprinting ， PMF） 对蛋白酶解后的 多肽混合物 进行质谱分析，与多肽 蛋白数据库中蛋白质的理论肽断进行比较，判断出 所测蛋白是已知还是未知。由于不同的蛋白质具有 不同的氨基酸序列，不同蛋白质所得肽断具有指纹 特征。 52 53 肽质谱指纹图在数据库中匹配 不成功的可能原因 样品量太少， PMF图信噪比太低，输入库中搜寻的数据质 量不好。 2-DE胶上所取的一个蛋白质点并非单一蛋白质，所获 PMF图实际上是两个以上蛋白质的混合图。 操作中角蛋白或其他蛋白质的污染 蛋白质发生了较多的转译后修饰，数据库中未有记载 所用胰蛋白酶质量不够好，蛋白酶自酶解片段多 未知的新蛋白质 数据库规模太小 54 串联质谱技术 (MS/MS) 是指多个质量分析器相连，分离 母离子 ，进行碰 撞解离，并检测 子离子 。 即选择一定质量的离子通过一级质谱 (MS1)，使 其进入碰撞室，与室内充有的碰撞气体 (常用气体 为 He、 Ar、 Xe、 CH4等 )进行碰撞诱导裂解 (collision-induced dissociation, CID)，发生离 子 -分子碰撞反应，产生 子离子 ，再经第二级质谱 (MS2)进行分析，最终导出肽序列。 鉴定蛋白质的方法 55 56 57 u组织切片或印片原位质谱分析技术 u两级飞行时间串联质谱（ MALDI-TOF/TOF） u傅里叶转换回旋共振质谱（ FTMS） u表面增强激光解吸 /电离飞行时间质谱（ SELDI- TOF-MS） 联合技术精确鉴定蛋白质 58 （四）蛋白质组学研究的生物信息学 生物信息学是蛋白质组学研究的一个不可 缺少的部分。蛋白质组数据库是蛋白质组研 究水平的标志和基础，数据库的种类繁多， 包括蛋白质序列数据库、质谱数据库、双向 电泳图谱数据库等等。 59 蛋白质组数据库是蛋白质组研究水平 的标志和基础 瑞士的 SWISS-PROT拥有目前世界上最 大、种类最多的蛋白质组数据库。 目前应用最普遍的数据库是 NRDB 和 dbEST数据库。 60 （五）定量蛋白质组学研究 概念： 把一个基因组表达的全部蛋白质或一 个复杂体系中所有的蛋白质进行精确的定量 和鉴定。 定量蛋白质研究的难点 ： 1.低丰度蛋白质检 测困难； 2.蛋白质表达量差异很小，如在 50%以下时，精确定量成为瓶颈； 3.蛋白质 表达的瞬时变化。 61 1基于双向凝胶电泳及其染色的定量技术 双向凝胶电泳 (2-DE)是目前唯一能分离展示大量 蛋白质并进行蛋白质定量分析的一种方法。 传统的染色方法：银染、考马斯亮蓝染色 荧光染料染色技术：双向荧光差异显示等。 62 2基于生物质谱的定量技术 原理： 对于具有相同离子化能力的蛋 白质或多肽，可以通过比较质谱峰的 强度（或峰面积）得到待比较蛋白质 的相对量。 63 二、蛋白质组功能模式的 研究方法 64 揭示蛋白质组成员间的相互作用、相互协 调的关系，并深入了解蛋白质的结构与功 能的相互关系，以及基因结构与蛋白质结 构功能的关系。 主要研究目标 65 （一）蛋白质翻译后修饰的研究 翻译后修饰 糖基化 乙酰化 甲基化 羧基化 二硫键磷酸化 去磷酸化 66 修饰肽的检测的高灵敏度方法 蛋白质翻译后修饰的定量分析 合适的修饰状态下处理和电离条件 测定工作量巨大 研究面临的困难 ： 67 （二）蛋白质相互作用研究技术 生命的基本过程是不同功能蛋白质在时空 上有序和协同作用； 新陈代谢以蛋白质复合体或多蛋白质网络 协同作用实现； 细胞信号转导及病原体感染和免疫反应。 68 1989年 Field 和 Song等人在酵母细胞 中设计的分析蛋白质相互作用的方法 。 以真核细胞转录激活因子的结构和活 性特点为基础的。 酵母双杂交系统 （ yeast two-hybrid system） 69 转录激活因子 GAL4的特点 N端含 NLS和与酵母 GAL1基因启动子上游激活 序列结合的结构域（ BD） C端含 GAL1转录激活结构域（ AD） 功能上相互独立又互相依赖，只有通过某种方式 结合在一起才具有完整的转录因子活性。 70 71 系统构建 构建与 GAL4 BD融合的蛋白表达载体 构建与 GAL4 AD 融合的蛋白表达载体 ； 建立 带有一个或多个报告基因 的酵母菌株 72 73 主要特点和优势 高效酵母转化方法操作简单，转化率高 ； 真实反应体内蛋白质间相互作用情况； 不需分离靶蛋白； 敏感性高。 74 1. 假阳性结果 2. 假阴性结果 3. 限于核内表达的蛋白质的相互作用 缺 点 75 噬菌体展示技术噬菌体展示技术 ( phage display ) 将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入 噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源多肽 或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌 体的重新组装而展示在噬菌体表面。被展示的多肽 或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性， 以利于靶分子的识别和结合 。 76 主 要 应 用 筛选与特异抗体或受体相互作用的蛋白质 研究抗体或受体的结合位点 构建随机肽库、抗体库和蛋白文库 改造和提高蛋白质的生物学和免疫学特性 研究新型多肽药物、疫苗和抗体 研究涉及到蛋白质与核酸相互作用的生物学 过程和新型的基因治疗导向系统 77 基于质谱的蛋白质相互作用研究方法 靶蛋白制备 蛋白质复合体的纯化 蛋白质 复合体 的质谱鉴定 基本步骤： 78 （ 1）亲和层析耦联质谱技术 基本原理： 将某种蛋白质以共价键固定在基质（ 如琼脂糖）上，含有与之相互作用的蛋白质的细 胞裂解液过柱，先用低盐溶液洗脱下未结合的蛋 白质，然后用高盐溶液或 SDS溶液洗脱结合在柱 子上的蛋白质，最后用多维液相色谱耦联质谱技 术（ MDLC-ESI-MS/MS）鉴定靶蛋白的结合蛋 白。 79 主要优点 灵敏度高：高浓度靶蛋白 候选蛋白质与靶蛋白的结合机会均等 检测多亚基蛋白质之间的相互作用 80 （ 2）免疫共沉淀耦联质谱技术 原理： 以细胞内源性靶蛋白为诱饵 ， 用抗 靶蛋白抗体与细胞总蛋白进行免疫共沉淀 （ immuno-precipitation， IP） 纯化靶蛋 白免疫复合物 ， 凝胶电泳分离后 ， 质谱鉴 定靶蛋白的结合蛋白。 81 82 研究鼻咽癌细胞系中的 p53 相互作用蛋白 抗 p53抗体与 HNE1和 HNE2总蛋白进行免 疫共沉淀 SDS-PAGE分离免疫沉淀复合物 切取 p53结合蛋白条带，酶解后进行电喷 雾串联质谱（ LC-ESI-MS/MS）分析，得 到相应的肽序列标签 搜索数据库 83 特 点 检