实验10双缩脲法测定蛋白质含量

实验十 双缩脲法测定蛋白质浓度一、实验目的1. 学习常见蛋白质含量测定的原理和方法2. 掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法二、原理一、分光光度法的基本原理及方法（一）利用吸收光谱对物质进行定性分析维生素 B12溶液的吸收光谱主要方法：（ 1）比较吸收光谱曲线（ 2）比较最大吸收波长蛋白质的最大吸收波长为 280nm；核酸的最大吸收波长为 260nm。（ 3）比较吸光度的比值纯 DNA：（二）利用吸收光谱对物质进行定量分析1原理Beer-Lambert（比尔）定律：T=I/I0A=lg1/T=lgI0/IA=cl 其中： T为透光率； A为吸光率； I0为入射光强度； I为透射光强度；为摩尔消光系数； C为溶液浓度； L为溶液光程的厚度2常用方法（ 1）标准曲线法 标准曲线与样品的测定条件必须一致。（ 2）标准管法 CX/AX=CS/AS，已知 CS，测定 AS、 AX可求得 CX。（ 3）摩尔吸光系数法C=A/（ 为 L=1cm， C为 1 mol/L时的吸光系数，也称为摩尔吸光系数。微量凯氏定氮法测定蛋白质总含量被测的天然含氮化合物与浓硫酸共热时分解出氨，氨与硫酸反应生成硫酸铵。在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液，使硫酸铵分解出氨。用水蒸汽蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸溶液进行滴定，滴定所用无机酸的量 (mol)相当于被测样品中氨的量（ mol），根据所测得的氨量即可计算样品的含氮量。 因为蛋白质含氮量通常在 16 % 左右，所以将凯氏定氮法测得的含氮量乘上系数 6.25，便得到该样品的蛋白质含量。 Folin-酚试剂法 (Lowry法 )测定蛋白质浓度 蛋白质含有两个以上的肽键 (CONH) ，因此有双缩脲反应，在碱性溶液中，能与 Cu2+形成络合物。 Folin酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进 Folin试剂 (磷钼酸 磷钨酸试剂 )，蛋白质 铜络合物能还原磷钼酸 磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。本法的优点是操作简便、灵敏度高、较紫外吸收法灵敏 1020 倍，较双缩脲法灵敏 100倍。其不足之处是此反应受多种因素干扰。（ Tris缓冲剂、蔗糖、硫酸铵、巯基化合物、酚、柠檬酸）。 紫外分光光度法测定蛋白质浓度 由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在 280 nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值 (OD280)与其含量呈正比关系，可用作定量测定。利用紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品、可回收利用、低浓度盐类不干扰测定。 含有核酸的样品：蛋白质浓度 (mg/ml)=1.45A280 0.74A260 总蛋白定量分析 BCA（ Bicinchoninic acid，二辛可宁酸、二羧基二喹啉）准确灵敏： BCA试剂的蛋白质测定范围是 202000g/ml； Micro BCA试剂测定范围是 0.5-20g/ml快速： 45分钟内完成测定，比经典的 Lowry法快 4倍而且更加方便经济实用：除试管外，测定可在微孔板中进行，大大节约样品和试剂用量不受样品中离子型和非离子型去污剂影响检测不同蛋白质分子的变异系数小于考马斯亮蓝基本原理：碱性条件下，蛋白将 Cu2+还原为 Cu+， Cu+与 BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在 562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度 考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律 ，因此可以通过测定染料在 595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。该法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高（比 Lowry法灵敏 4倍）。 Coomassie Dye-Based 蛋白质定量PROTEIN +Amax = 595nmBLUEAcidCoomassie G-250Protein - DyeComplexO CH2CH3NHCCH3 CH3NCH2SO3-CH3CH2 NCH2CH2CH3SO3Na+双缩脲法测定蛋白质 *双缩脲反应： 双缩脲在碱性条件下与铜离子结合生成紫红色化合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比。本法测定蛋白质范围 1-10mgH2N-CO-NH2 + NH2-CO-NH2 H2N-CO-NH-CO-NH2 NH3双缩脲三、操作步骤1.取 15支试管，按下表编号、加试剂2.各管 混匀 后，加入双缩脲试剂 3.0mL,37oC反应 30min。3.以 0号管调零 ，测定各管 540nm光吸收值。四、结果处理1.绘制标准曲线以牛血清白蛋白含量为横坐标， OD540为纵坐标， 绘制标准曲线 。2.样品的计算根据样品的 OD540从标准曲线上查得样品的蛋白质含量（ mg/mL），再根据样品的体积算出样品的浓度。五、注意事项1. 须于显色后 30min内测定 ，且各管由显色到比色时间应尽可能 一致 。2.*样品蛋白质含量应在标准曲线范围内。3. 比色杯的使用微量表达法10-3 (g, m, L) milligram 毫（克） mg10-6 microgram 微（克） g10-9 nanogram 纳（克） ng10-12 picogram 皮 （克） pg10-15 femtogram 飞（克） fg10-18 attogram 阿、渺（克） ag 10-24 zepto（仄普托） 沙（克） zgppm: parts per million 1 g/ml 1ppmppb: parts per billion 1 ng/ml 1ppbppt: parts per trillion 1 pg/ml 1ppt五、分光光度计的使用仪器操作键介绍“方式设定 ”键（ MODE）：用于设置测试方式“100%T/0ABS” 键：用于自动调整100.0%T(100.0 透射比 )或 0ABS(零吸光度 )“0%T” 键：用于自动调整零透射比“波长设置 ”旋钮：用于设置分析波长3.样品测试操作 打开电源开关，使仪器预热 20分钟 用 “波长设置 ”按钮将波长设置在您将要使用的分析波长位置上 打开样品室盖，将挡光体插入比色皿架，并将其推或拉入光路 盖好样品室盖，按 “0%T” 键调透射比零 取出挡光体，盖好样品室盖，按 “100%T” 调 100% 透射比 按 “方式键 ”（ MODE）将测试方式设置为吸光度方式 (A) 将参比溶液和被测溶液分别倒入比