实验肠道致病菌分离鉴定

微生物学实验四,肠道致病菌分离鉴定,微生物学教研室 郭棵棵,（综合性实验）,1,录像：球菌操作：1、化脓性球菌分离鉴定（二） （1）革兰染色 （2）转种甘露醇或血清肉汤 （3）血浆凝固酶实验 （4）触酶实验 2、肠道菌分离鉴定（一） 粪便标本接种S.S平板材料：（1）载玻片 1-2 张/人 （2）甘露醇或血清肉汤 1支/人 （3）新鲜兔血浆、生理盐水 各1支/6人 （4）S.S平板 1块/人 （5）粪便标本：伤寒、痢疾、副甲、副乙 1套/教室,实验内容,2,了解：肠道致病菌的血清学鉴定 触酶实验、血浆凝固酶实验的原理掌握： 1. 肠道致病菌分离鉴定的方法、步骤及生化反应 2. 化脓性球菌转种甘露醇或血清肉汤的目的 3. 触酶、血浆凝固酶实验的结果观察,教学目标,3,观察上次实验结果、进行分析,紫外线杀菌实验,4,抗生素敏感试验,抑菌圈直径,5,如果细菌对药物敏感，则在药片周围有抑菌圈形成，敏感度越高抑菌圈直径越大： 20mm：极度敏感 5-20mm：中度敏感 10-15mm：轻度敏感 10mm: 不敏感 无抑菌圈: 耐药,6,化脓性球菌分离鉴定（二）,脓汁,血平板,菌落,葡萄状排列,链状排列,血浆凝固酶实验,甘露醇发酵实验,血清肉汤管,接种,三线法,37,24h,革兰染色,触酶实验,排列不典型,7,2、操作,革兰染色及镜检触酶实验血浆凝固酶实验转种甘露醇或血清肉汤,8,涂片：先在玻片上放一滴生理盐水，然后刮取菌落 在盐水中乳化，涂成直径约为1.0 cm的膜。 干燥：最好在室温中自然干燥，也可在远离火焰上 方微微烘干。但切勿靠火焰以免烤焦标本。 固定：火焰固定。 革兰染色过程： 初染： 结晶紫 1分钟 媒染： 碘液 1分钟 脱色： 95%酒精 半分钟 复染： 稀释复红 半分钟 镜检：球阳杆阴 阳紫阴红,（1）革兰染色,9,葡萄球菌,链球菌,10,（2）触酶实验,原理：产生过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和分子氧出现气泡。,操作步骤：,在洁净玻片上滴一滴生理盐水，用接种环取少许细菌培养物与生理盐水中乳磨均匀，然后加3过氧化氢数滴；或直接滴加3过氧化氢于不含血液的细菌培养物中，立即观察结果。,11,结果观察：有大量气泡产生者为阳性。不产生气泡者为阴性。,G+球菌中，葡萄球菌和微球菌均产生过氧化氢酶，而链球菌属为阴性，故此试验常用于G+球菌的初步分群,12,（3）血浆凝固酶试验,1）原理 致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，在血浆中激活剂的作用下，可使血浆中的纤维蛋白原转变为不溶性的纤维蛋白，导致血浆凝固；而非致病性葡萄球菌由于不产生此酶，故不能凝固血浆，二者可据此予以区别。,13,2）操作：玻片法,取干净玻片一块血浆及生理盐水各一滴，分别置于玻片两端用接种环取细菌少许，分别与生理盐水及血浆充分混匀结果观察：30秒钟内盐水中的细菌呈均匀浑浊，而兔血浆则呈块状或颗粒状者为阳性。,14,（4）甘露醇试验或血清肉汤接种,1）甘露醇发酵试验： 接种甘露醇单糖管，观察颜色改变及气体产生 情况。 发酵甘露醇产酸者，使酸碱指示剂（溴麝香 草酚兰）在酸性环境下由蓝色转变为黄色。 2）接种血清肉汤：观察细菌生长状态 沉淀生长？ 混浊生长？ 部分沉淀，上清液混浊生长？,15,肠道菌分离鉴定（一）,肠道杆菌是一大群寄居在人类和动物的肠道中的生物学性状近似的革兰阴性的杆菌，该类细菌无芽胞，多数有周鞭毛。需氧或兼性厌氧，能分解葡萄糖及其他碳水化合物，产酸、有些产气。,多数肠道菌是肠道的正常菌群，当宿主免疫力降低或侵入肠道外等部位时，也可成为条件致病菌引起疾病。有的肠道杆菌例如伤寒沙门菌、志贺氏菌、致病性大肠杆菌等，是肠道致病菌，可导致人类某些肠道传染病。,16,肠道菌的种类繁多，为成功地检出病原菌，通常选用选择或鉴别培养基。除提供细菌生长所需营养物外，还含有抑菌剂和指示剂。可有选择性抑制某些肠道细菌的生长，指示剂则能鉴别细菌的生化特性。,本次试验以粪便为标本进行肠道菌的分离鉴定。粪便标本中含有伤寒杆菌、副伤寒杆菌、痢疾杆菌以及大肠杆菌等肠道菌，要求从标本中分离出单一的致病菌，并通过后续的试验鉴定出致病菌。,17,S.S琼脂培养基中含有胆盐、煌绿和枸橼酸钠等成分，不仅能抑制G+菌的生长，也能抑制肠道非致病菌的生长。,S.S琼脂培养基,大肠杆菌在此平板上生长，可分解培养基中乳糖产酸，与胆盐作用形成胆酸沉淀，使中性红指示剂变红，形成红色浑浊不透明菌落。肠道致病菌则不分解乳糖，形成无色或淡黄色菌落（因分解蛋白质产生碱性物质）。,18,SS琼脂培养基（Salmonella-Shigella agar）,大肠埃希菌,沙门菌,志贺菌,19,操作：,粪便,S.S.平板,挑选可疑菌落,培养24h,37,接种,三线法,肠道菌分离鉴定（一）,20,1、用无菌接种环挑取少量粪便标本，用划线法 接种于S.S平板上进行分离培养。2、放置于37C孵箱内培养18-24小时，观察平板上所生长的菌落