17 第17章_流式细胞仪分析技术及应用

1、第十七章流式细胞仪分析技术及应用第三节 流式细胞仪免疫分析的技术要求一、免疫检测样品制备二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色三、免疫胶乳颗粒的应用四、流式细胞免疫学技术的质量控制第二节 数据的显示与分析一、参数二、数据显示方式三、设门分析技术第一节 概述一、工作原理二、散射光的测定三、荧光测量四、细胞分选原理思考题小结第四节流式细胞术在免疫学检查中的应用一、淋巴细胞及其亚群的分析二、淋巴细胞功能分析三、淋巴造血系统分化抗原及白血病免疫分型四、肿瘤耐药相关蛋白分析五、AIDS病检测中的应用六、自身免疫性疾病相关HLA抗原分析七、移植免疫中的应用1934年，Moldaven 是世界上最早设想使细

2、胞检测自动化的人，他试图用光电仪记录流过一根毛细管的细胞。 1953年，Croslannd- Taylor 应用分层鞘流原理，成功的设计红细胞光学自动计数器。同年，Parker 和Horst描述一种全血细胞计数器装置，成为流式细胞仪的雏形。1968年斯坦福大学研制出第一台以荧光活化的细胞筛选仪（ Fluorescence-activatedcellsorter，FACS）。1973年BD公司以FACS的商品名称出品了第一台商业化的流式细胞仪，1975年美国BeckmanCoulter（BC）公司研制出第一台带计算机的流式，进入九十年代，流式细胞术作为一门生物检测技术已经日臻完善 。随后，科学家

3、们、仪器制造商们又纷纷将研究焦点转向荧光染料的开发、细胞的制备方法和提高电子信号的处理能力上来。而今，流式细胞仪已经深入到生物学、医学、药物学等的各个分支领域，并将在未来为我们的科学研究发挥更大的作用。流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。流式细胞术的特点细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下， 通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种 信号对细胞进行定量分析或纯化分选。FACSCalibur特点： 光

4、路调节系统固定 自动化程度高 操作简便 使用寿命长 配备1-2根激光 细胞分选速度慢，主要用于细胞分析临床型（台式机）FACSAria特点： 分辨率高 选配多种波长和类型激光器 可把感兴趣细胞分选到特定培养孔或板上（4路和24孔板） 适用于高速分选和多色分析科研型第一节 概述流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类收集的高技术。流式细胞仪常检测的细胞特性细胞组成细胞功能大小细胞表面/胞浆/核-特异性抗原粒度细胞活性DNA, RNA含量胞内细胞因子蛋白质

5、含量激素结合位点钙离子, PH值, 膜电位酶活性一、工作原理 采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率； 利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性； 用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。1.流式细胞仪的基本结构：（1） 液流系统（2） 光学系统（3） 数据处理系统（1）液流系统由样本和鞘液组成待测细胞抗对其染色单个细胞的悬液受清洁气体压力荧光染料标记的单从样品管进入流动室形成样本流鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠

6、近孔壁而阻塞喷孔。样本流SAMPLE 单细胞悬液5*1051*106个/ml液流系统示意图喷嘴鞘液FluorescencesignalsFocused laserbeam FCM的液流系统（如 何形成单个细胞流）大多数仪器是在50-300 m 大小的孔径中,将细胞悬液注射进入鞘液中鞘液管样本管（2）光学系统 激光光源：气冷式氩离子激光器 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 透镜组：形成平行光，除去室内光 滤片：长通、短通、带通 光电倍增管：FS, SS（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）光学系统示意图光，长、单一方向、高强度的稳定

7、光照。FlowTipSS and FL侧向散射Detector荧光前向散射光Laser激光 (Laser)是一种相干光源，它能提供单一波FS Detector（3）数据处理系统 主要由计算机及其软件组成基本工作原理硅化管形成稳态水平激光与之 荧光染料被已标记的单细胞悬液和鞘液流动室喷嘴激发发光单细胞液柱垂直相交荧光检测系统和放大光电倍增管计算机系统分析结果收集光信号脉冲信号散射光感受系统基本过程区别流式细胞仪显微镜光源激光自然光、灯光对象细胞、生物粒子细胞、组织等承载工具鞘液及流动室载玻片检测信号光学信号形态及染色放大方式PMT、放大电路目镜物镜、光学放大统计计算机，5000人工，200结果多

8、参数，综合分析简单，单参数流式细胞仪与显微镜的区别二、散射光的测定细胞在液柱中与激光束相交时向周围360立体角方向散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要分为前向散射光和侧向散射光。前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0.510)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。前向散射光示意图LaserFALS Sensor侧向散射光（side scatter, SS）：激光束照射细胞时，光以90角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。侧向散射光示意图LaserFALS Sensor

9、90LS Sensor测得的FS与SS信号通过计算机处理， 可得到FS-SS图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。此为血细胞分类的基本原理，但不能分析表面分子。中性粒细胞单核细胞淋巴细胞光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群三、荧光测量荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。 每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。线性放大器和对数放大器荧光染料的特性 激发波长(EXCITING

10、) 发射波长(EMISSION)荧光补偿各荧光染料发射的荧光信号有重迭, 因此要进行色补偿以除去重迭部分四、细胞分选原理通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。细胞悬液形成液流柱压电晶体产生机械振动流动室振动液流断裂成液滴空白液滴含细胞的液滴充电偏转落入收集器不充电弃去（一）分选基本原理 分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细胞的含量成正比。 分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞的百分率。 分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。 分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细 胞的总量，再经分选后得到目

11、的细胞的实际得率。与分选速度成反比。（二）分选的技术要求第二节 数据的显示与分析 参数：FS,SS,FL 数据显示方式 （单参数直方图 、双参数散点图 、二维等高图 、假三维等高图 、三参数散点图 ） 设门分析技术一、 参数FS：反映颗粒的大小SS：反映颗粒的内部结构复杂程度FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少二、数据显示方式直分析方图 单参数直方图 双参数直方图:点图二维等高图 假三维等高图 三参数直方图 多参数分析设门分析:REGION和GATE设置（一）单参数直方图由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。 单参数直方图信道(chan

12、nel )细胞相对数量（二）双参数直方图 双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。 双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个细胞， 点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。 1.双参数直方图点图 绿色荧光强度红色荧光强度 双参数直方图点图2. 二维等高图 由类似地图上的等高线组成，其本质也是双参数直方图。 等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等高”。 曲线层次越高(越里面的线) 所代表的细胞数愈多。 等高线越密集则表示细胞数变化率越大。 二维等高图3. 假三维等高图

13、（三）三参数直方图（四）流式细胞仪的多参数分析多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激发光激发后，得到的荧光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析。三、设门分析技术Gate设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。ABC淋巴细胞单核细胞中性粒细胞A、B、C均为任意门线性门 Region设置:区阈（region, R）与门(gate, G ) 是两个相关的概念，区阈可与门对应，但是也可以包含于门。D1 CD4+/CD3-

14、 D2 CD4+/CD3+ D3 CD4- /CD3-D4 CD4- /CD3+如十字门分析时，起就可以由四个区域构成，即G=D1+D2+D3+D4。第四节 流式细胞仪免疫分析的技术要求 样本制备 标记染色 液相芯片技术 质量控制一、免疫检测样品制备单细胞悬液 外周巴细胞样品的制备分离单个核细胞 培养细胞的样品制备蛋白酶消化洗涤机械吹打尼龙网过滤使贴壁细胞脱落 新鲜实体组织单细胞悬液的制备 机械法 酶处理法 化学试剂处理法 表面活性剂处理法 单细胞悬液的保存 深低温保存法（一年） 乙醇或甲醇保存法（2周） 甲醛或多聚甲醛保存法（2月）二、常用的荧光染料与标记染色适用条件: 有较高的量子产额和消

15、光系数 对488nm的激发光波长有较强的吸收 发射光波长与激发光波长间有较大的波长差 易与标记单抗结合而不影响抗体的特异性（一）几种常见的荧光染料细胞悬FL1液FITC异硫酸荧光素激光FL2Texas red得州红FL3PE.PC.APC藻胆蛋白类PEcy5能量传递复合染料FL4名称染料激发波长荧光颜色溶解性对PH敏感性特点异硫酸荧光素FITC488绿525易敏感易溶于水，与抗体结合不影响特异性得州红Texasred568红615不易不敏感稳定，偶联后量子产额低藻红蛋白PE488橙575易不敏感具较多发光基团，消光系数和量子产额高藻青蛋白PC488别藻青蛋白APC633红670能量传递复合染料

16、PEcy5488红670易不敏感减少交叉，成本高常用的几类荧光染料用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在488nm激发光照射下，通过一个荧光染料被激发后产生的发射波长再激发另一荧光染料产生荧光信号，从而检测到该特定荧光信号。减少补偿，荧光重叠能量传递复合染料能量传递复合染料机制575nmCY5670nm红色荧光488nmPECY5CY5藻红蛋白花青苷5（二）免疫荧光标记 荧光染料与细胞成分的四种结合方式结构亲和式嵌 入 结 合 共价键结合荧光标记抗体特异性结合 免疫荧光标记方法直标:干扰少,但需购买多种单抗间标:步骤多,干扰多,不需标记多种抗体组合标记三、免疫胶乳颗粒技术的应用免疫胶乳

17、颗粒的应用即液相芯片技术是把微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色，把针对不同检测物的乳胶微球混合后再加入待标本，在悬液中与微粒进行特异性地结合，经激光照射后不同待测特产生不同颜色，并可进行定量分析。因检测速度极快，所以又有“液相芯片”之称 。微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色（固相芯片是用探针在芯片上的坐标位置给基因的特异性编码；而液相芯片则是用颜色来编码）通过对标记不同荧光素分子的检测，实现FCM对可溶性物质的定量分析四、流式细胞免疫学技术的质量控制（一）单细胞悬液制备的质控 适当的制备方式 处理红细胞 实体组织来源标本用机械法 温度2537，pH7.07.2（二）免疫荧光染色的质

18、控 温度 pH 染料浓度 固定剂（三）仪器操作的质控 光路与流路校正: 确保激光光路与样品流处于正交状态，减少变异（CV）。 Flow-check PMT（光电倍增管）校准: 保证样品检测时仪器处于最佳灵敏度工作状态。 Flow-set 绝对计数校准: 保证计数的准确性。 Flow-count（四）免疫检测的质控 同型对照：即免疫荧光标记中的对照，选用相同源性的未标记单抗作为对照调整和设置电压，以保证特异性。 全程质量控制：与待测标本一起标记和检测， 结果达靶值，提示本次实验结果可靠。第四节在免疫学检验中的应用流式细胞术目前已广泛地被应用于免疫学基础研究和逐步进入临床应用各方面，用流式细胞仪对

19、细胞表面的抗原成分进行标记分析， 可区别多种细胞的特性，为细胞免疫的研究增加了有效的手段和帮助。一、淋巴细胞及其亚群的分析T淋巴细胞及其亚群分析Th(CD3+CD4+CD8-T); Tc(CD3+CD4-CD8+T)B淋巴细胞及其亚群分析B1(CD19+CD5+):产生IgM型自身抗体, 参与免疫调节、与自身免疫病的发生有关B2(CD19+CD5-):受外来抗原刺激, 产生高亲和性特异性抗体NK细胞分析NK(CD3-CD16+CD56+)二、淋巴细胞功能分析 细胞介导细胞毒性试验(死细胞与活细胞比例) 细胞内细胞因子测定三、淋巴造血系统及白血病免疫分型 对淋巴瘤和白血病进行多色免疫分型 用于选择化疗方案、判断预后及检出微小残留病变人外周巴细胞亚群检测T淋巴细胞检测T淋巴细胞淋巴细胞CD4+T（Th)淋巴细胞检测CD4+淋巴细胞R1CD8+Ts淋巴细胞检测CD8+淋巴细胞R1四、肿瘤耐药基因分析MDR(+)表示对化疗药物耐药五、AIDS病检测中的应用CD4+Th细胞、CD4+/CD8+比例六、自身免疫病相关HLA抗原分析HLA-B27可出现在58%97%的强直性脊椎炎(