细菌内毒素检查技术培训班-讲-义.ppt

1、2007-9-10,Bitab,1,细菌内毒素检查技术讲 义,北京毕特博生物技术有限责任公司 2007年9月,2007-9-10,Bitab,2,目 录,一、细菌内毒素检查的基础理论-3 二、 BET试验前的准备-24 三、细菌内毒素检查的实验技术-28 1，鲎试剂灵敏度复核-33 2，干扰初筛试验-40 3，干扰试验-49 4，检查法-62 四、细菌内毒素检测技术的发展,2007-9-10,Bitab,3,一、细菌内毒素检查的基础理论,1，细菌内毒素 2，鲎试剂 3，BET用水 4，BET程序 5，2005年版细菌内毒素检查法 6，相关参数的计算 7，试验的相关知识,2007-9-10,Bi

2、tab,4,1、细菌内毒素1）化学成分及特性 - 革兰氏阴性细菌细胞壁的产物 - 是高分子量脂多糖复合物（LPS） 除上述性质外，LPS还有许多其他的生物活性,（1）特性,2007-9-10,Bitab,5,内毒素的分子结构,（2）化学结构 - 含有3个截然不同的区域,O- 特异侧链 核心多糖 类脂A,2007-9-10,Bitab,6,2） 内毒素与热原的关系 - 内毒素是热原之一种- 医药工业接受的观点是，内毒素是目前医药工业中最普遍和最主要的外源性热原，控制内毒素污染就等于控制热原污染。 3）标准内毒素和环境内毒素1）标准内毒素经人工提取精制并经生物效价测定的细菌内毒素，作为BET检查的

3、参考品或对照品。主要分参考标准品（RSE）及工作标准品（CSE）。CSE的效价必须用RSE来标化。目前CSE的效价有两种标示方法：固定效价法（中国）及浮动效价法（国际）。2）环境内毒素天然产生的内毒素，普遍存在于水、空气及各种原料中，成分除了脂多糖外还含有较多的蛋白质、多糖和其他杂质，其极性不明显，致热性较标准内毒素弱。BET的对象是环境内毒素。,2007-9-10,Bitab,7,4）标准内毒素溶液（C溶液）的制备 1）中国药典2005年版的BET法规定，将细菌内毒素国家标准品用细菌内毒素检查用水溶解后，需在旋涡混合器上混匀15分钟，以后每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟，其他国家药典

4、都有类似要求 - 具有极性的内毒素分子在水中呈现不均匀分布,2007-9-10,Bitab,8,2、鲎试剂,1）鲎试剂的分类 - 根据鲎的种类分类 美洲鲎试剂(LAL) 中国鲎试剂或东方鲎试剂（TAL） - 根据检查方法分类 凝胶法鲎试剂 光度法鲎试剂 - 根据鲎试剂的反应特异性分类 普通鲎试剂 特异型鲎试剂,2007-9-10,Bitab,9,2）鲎试剂的规格 - 一般分单次试验试剂和多次试验试剂（也称大装量试剂） - 把自身的包装容器作为反应管的试剂称为单次试验试剂，在国内使用的0.1ml/支的鲎试剂就属于单次试验试剂 - 多次试验试剂有0.5ml/支、1.2ml/支等，使用时应先用相应量

5、的溶解液复溶鲎试剂。,2007-9-10,Bitab,10,3）鲎试剂的质量标准 - 灵敏度 定义：再细菌内毒素检查法规定的条件下，能使鲎试剂产生凝集的标准内毒素的最低浓度，单位EU/ml。 常用鲎试剂的灵敏度：0.5EU/ml、 0.25EU/ml、 0.125EU/ml、 0.06EU/ml、0.03EU/ml - 自身凝集 部颁标准，鲎试剂的阴性对照在37度4小时不产生凝集反应 - 缓冲能力 - 干燥失重 - 无菌：中国标准无此项要求,2007-9-10,Bitab,11,4）鲎试剂与内毒素的反应机理,C因子,活化的C因子,内毒素,活化的B因子,B因子,凝固酶,凝固酶原,凝固蛋白（凝胶）

6、,凝固蛋白原,葡聚糖或LAL-RM,活化的G因子,G因子,二价阳离子,AC-lle-Glu-Ala-Arg-pNA,（酶作用物）,AC-lle-Glu-Ala-Arg-OH,pNA,405nm测吸光度值,（对硝基苯胺 黄色）,2007-9-10,Bitab,12,3、BET用水,2000年版药典要求，BET用水应为与0.03EU/ml或更高灵敏度的鲎试剂在371条件下24小时不产生凝集反应的灭菌注射用水。 2005年版药典要求，凝胶法BET用水应为内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水；光度测定法用的BET用水内毒素含量应少于0.005EU/ml。 美国药典要求的BET用水是指与所使

7、用的鲎试剂不发生反应的灭菌注射用水或其他水。,2007-9-10,Bitab,13,4、BET程序,1）验证实验 凝胶法 光度测定法 2）检查法 凝胶法 光度测定法 动态法 终点法：终点比色法试验,灵敏度的复核试验,干扰试验,标准曲线可靠性试验,干扰试验,凝胶限量试验,凝胶半定量试验,动态比浊法试验,动态比色法试验,动态终点法,2007-9-10,Bitab,14,5、中国药典2005年版细菌内毒素检查法,1）综述部分 细菌内毒素检查法的定义及BET方法学分类 内毒素标准品及检查用水 BET器具的要求 供试品溶液的要求 内毒素限值的确定 最大有效稀释倍数的计算,2007-9-10,Bitab,

8、15,2）试验部分,（1）凝胶法 鲎试剂灵敏度复核试验 干扰试验 检查法 （2）光度测定法 标准曲线的可靠性试验 干扰试验 检查法,3）2005年版药典BET法际验部分主要内容,凝胶限量试验,凝胶半定量试验,2007-9-10,Bitab,16,2007-9-10,Bitab,17,1）内毒素限值 （1）药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定：L=K/M L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg(活性单位)表示； K为人每公斤体重每小时科接受的最大内毒素剂量，以EU/(kgh)表示，注射剂K=5 EU/(kgh),放射性药品注射剂K=2 EU/(kgh),鞘内用注射

9、剂K=0.2 EU/(kgh), M为人每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以ml/(kgh)、mg/(kgh)、 U/(kgh)表示，人均体重按60Kg计算，注射试剂若不足1小时，按1小时计算。,6、相关参数的计算,2007-9-10,Bitab,18,（2）内毒素限值计算举例 - 注射用的头孢曲松钠舒巴坦钠，成人最大剂量为1500mg/次 L= =0.20EU/mg - 注射用人头孢孟多酯钠，成人每日剂量为2.0至8.0g，分3至4次给药，一日最高剂量不超过12g L= =0.075EU/mg - 对于大输液（LVP）,美国药典（USP）通常都取L值为0.5EU/ml,5 EU/(kgh),

10、1500 mg/(60kgh),5 EU/(kgh),(12000mg/3) / (60kgh),2007-9-10,Bitab,19,2）最大有效稀释倍数 - 供试品最大有效稀释倍数（MVD）按以下公式计算 MVD=CL/ C为供试品溶液的浓度，其中当L以EU/ml表示时，C为1.0ml/ml;当L以EU/mg或EU/U表示时,C的单位为mg/ml或 U/ml。凝胶发中，为鲎试剂的灵敏度 光度测定法中，为标准曲线最低浓度 - 如使用鲎试剂灵敏度为0.25EU/ml，注射用头孢曲松钠舒巴钠（浓度为10mg/ml,L=0.2EU/mg）的最大有效稀释倍数为 MVD= =8 (倍),10mg/ml

11、 x 0.2EU/mg,0.25EU/ml,2007-9-10,Bitab,20,3）最低有效稀释浓度(MVC) - MVC=/ L - 如使用鲎试剂灵敏度为0.25EU/ml，注射用头孢曲松钠舒巴钠的最低有效浓度为 MVC= = 1.25mg/ml 4) 样品稀释过程中加液量的计算 - 稀释过程中，假设从溶液S1取（x）ml溶液稀释（n）倍至S2，加液量为（y）,则满足： y= (n-1) X x - 如从溶液S1取0.5ml稀释3.8倍至S2,则加液量为： y=(3.8-1) X 0.5=1.4ml 即0.5ml的S1加1.4ml稀释液即得S1的3.8倍稀释液S2,0.20EU/mg,0.

12、25EU/ml,2007-9-10,Bitab,21,7、试验相关知识,1) 内毒素标准品的使用 （1）复溶 - 复溶2ml安瓿装的内毒素标准品，为了避免溶液再混合时溢出安瓿，我们建议在安瓿颈部上方开口加液。 复溶液的体积一般为1ml,或根据使用说明书加液。 （2）效价 - 厂家必须向用户提供一份效价分析证书（Certificate of Analysis,CoA） 效价分析证书应注明：RSE/CSE _EU/mg; _ng/瓶,2007-9-10,Bitab,22,2) 鲎试剂的使用 - 使用前，应将鲎试剂置于室温环境下使其大道室温温度鲎再复溶使用 - 复溶鲎试剂鲎，应避免强烈振动产生泡沫

13、- 由于鲎试剂与内毒素凝集反应的不可逆性，反应过程中必须避免反应试管的振动造成假阳性 3）内毒素的清除 （1） 冲洗 适用于器械组件、塞子等 可用于加热等方法提高清除效率 （2）蒸馏，折流系统和地心引力阻止大分子量的LPS转变为蒸汽状态逸出 （3）反渗透 （4） 超滤 （5）活性炭吸附,2007-9-10,Bitab,23,4）内毒素的灭活 （1） 酸/碱水解 （2）氧化 - H2O2 （3）干热 - 250，30分钟的干烤,2007-9-10,Bitab,24,二、BET试验前的准备,1. 在细菌内毒素检查试验中，凡是与试验样品或试剂接触的器具必须经过除热原处理。 玻璃器皿一般用洗液浸泡4小

14、时后，用自来水冲洗，再用真馏水冲洗、晾干。最后在280干烤至少120分钟。,2007-9-10,Bitab,25,2. 试验所试用的器具主要包括有： 无热原稀释管 无热原玻璃移液管 无热原玻璃毛细管 稀释试管架 安瓿试管架 反应试管架 可调移液器 连接胶粒 无热原吸头 安瓿开启器 70%的异丙醇浸泡的无纺布拭布,2007-9-10,Bitab,26,3. 实验中也可用一次性的无热原塑料器械。 如用可调移液器和无热原吸头代替无热院玻璃移液管取液等。 在使用可调移液器连接无热原毛细管吸取微量溶液时，采用多吸少打方式。避免由于毛细管的虹吸作用带来的加样误差；也可避免微量加样时产生气泡。,2007-9

15、-10,Bitab,27,4. 细菌内毒素检查实验的恒温反应在37的恒温器中进行。 TAL-40型试管恒温仪（安度斯设计生产），专门用于细菌内毒素检查的恒温仪器。具有 A, 温度稳定； B, 加热均匀； C, 定时报警等特点,2007-9-10,Bitab,28,三、凝胶法细菌内毒素检查技术,1，凝胶法BET试验程序 2，试验器具 3，鲎试剂灵敏度复核 4，干扰初筛试验 5，干扰试验 6，检查法,2007-9-10,Bitab,29,1、凝胶法BET的实验程序 1）试验准备：试剂、仪器及实验用具等 2）确定供试品的内毒素限值（L） 3）选择鲎试剂（） 4）计算供试品的最大有效稀释（MVD）或最

16、低有效浓度（MVC） 5）鲎试剂灵敏度复核 6）供试品干扰初筛试验（建议试验） 7）供试品干扰验证试验 8）供试品日常检查,2007-9-10,Bitab,30,2、试验器具,1）器具的要求及处理-玻璃器皿需除热原处理，以除去可能存在的外源性内毒素，常用方法是玻璃器皿经清洗后250至少干烤1小时 -塑料器械应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械 -首选硼硅酸盐玻璃器具或同等作用的聚苯乙烯塑料器具 2）孵育反应仪器 温度精确：370.2 发热均匀：0.1 可定时提示：0至90分钟可设定定时蜂鸣提示 试管免封口,2007-9-10,Bitab,31,3 、鲎试剂灵敏度复核试验,1）鲎试剂灵敏度复

17、核实验目的1）验证实验室的条件是否满足BET实验的要求2）验证实验人员的操作技能是否满足BET实验的要求 3）验证实验所用试剂（包括鲎试剂、内毒素标准品、BET用水等）是否满足BET实验的要求 2）鲎试剂灵敏度复核实验的步骤1）恒温仪器预热2）C溶液（标准内毒素溶液）的制备3）鲎试剂制备4）加样及恒温反应5）结果判断6）数据处理,2007-9-10,Bitab,32,稀释为2、0.5、0.25内毒素标准溶液,C溶液反应：0.1mlTAL0.1mlCSE(RSE)，平行4管 D溶液反应：0.1mlTAL0.1mlBET水，平行2管,单次管：原安瓿 多次管：反应试管,轻轻转动瓶壁摇匀,每步稀释于旋

18、涡混合器混合30s,旋涡混合器混合15min,混匀,混合,BET水复溶,BET水复溶,RSE或CSE,鲎试剂TAL,371，60min2min,混匀（水浴恒温需封口）,3）操作步骤示意图,2007-9-10,Bitab,33,4）灵敏度复核试验举例 (1) 试剂,2007-9-10,Bitab,34,（2）实验前，将恒温仪器预热至37 （3）标准内毒素溶液（C溶液）的制备,2007-9-10,Bitab,35,（4）鲎试剂的准备取0.1ml装量，灵敏度为0.25EU/ml的鲎试剂18支，在安瓿颈部折断，按照阴性对照溶液D两支，标准内毒素溶液每浓度平行4管排列： 用精确移液器准确吸取0.1mlB

19、ET水分别加入每支鲎试剂中，使鲎试剂全部溶解,0.5U/ml,阴性对照溶液D,0.25EU/ml,0.125EU/ml,0.06EU/ml,2007-9-10,Bitab,36,（5）加 样,用精确移液器分别吸取0.1ml的0.06EU/ml、 0.125EU/ml、 0.25EU/ml、0.5EU/ml的标准内毒素溶液，加入已复溶的鲎试剂中，每平行4管，吸取0.1mlBET用水（D溶液）加入另外两支鲎试剂内，作为阴性对照。,加样顺序一般从低浓度到高浓度,2007-9-10,Bitab,37,（6）恒温反应 - 将加样完的混合液轻轻摇匀（避免产生气泡），放入371 的恒温器中孵育602分钟（孵

20、育过程中避免振动影响凝胶形成） -若保温装置是水浴恒温箱，那么在加样后需将反应管封口，避免水蒸气进入反应管内造成污染。的混合液需封口后再将其放入水浴中恒温反应,2007-9-10,Bitab,38,（6）结果判断将反应试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性，记录为“”；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性，记录为“-”。,结果判断：反应管缓缓倒转180 阳性(+)：凝胶不变形，不从管壁滑脱者 阴性(-)：凝胶不能保持完整，从管壁滑脱者 实验符合要求的基本条件： NC管全部阴性 （） 2管全部阳性 （） 0.25管全部阴性

21、（）,2007-9-10,Bitab,39,（7）数据处理 c =lg-1（X/4） =lg-1(0.903)(0.602)(0. 602)(0. 602)/4 = 0.210EU/ml 即在本批号鲎试剂的复核灵敏度（ c ）为0.21EU/ml 药典要求：c在0.5 2.0（包括0.5和2）时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度为该批鲎试剂的灵敏度值。 结论：本批TAL的灵敏度标示值符合规定，按标示值使用!,2007-9-10,Bitab,40,4、干扰初筛试验,1）目的及原理： -本试验是药品与鲎试剂相容性的筛选试验，通过对一系列含2内毒素浓度的样品溶液与鲎试剂的反应，初步筛选出对鲎试

22、验无干扰的浓度。 -本试验可减少干扰试验的盲目性 2）试验步骤 供试品限值的确定 供试品最大有效稀释倍数的确定 试剂的选择 反应溶液的制备 加样及反应 结果判断,2007-9-10,Bitab,41,（1）供试品限值 -硫酸庆大霉素，100ml/瓶，20000U/ml； -药典要求，硫酸庆大霉素限值L=0.5EU/1000U （2）最大有效稀释倍数的确定 -最大有效稀释倍数MVD=cL/； -使用=0.5EU/ml灵敏度的鲎试剂时， MVD0.5= =20 倍 -由此可计算出使用不同时所对应的MVD:,3) 干扰初筛试验举例,20000U/ml x 0.5EU/1000U,0.5EU/ml,2

23、007-9-10,Bitab,42,-由此可计算出使用不同时所对应的MVD: （3）试剂,2007-9-10,Bitab,43,（4）各反应溶液的制备,2007-9-10,Bitab,44,溶液C的制备 E100 E10 E1 E0.5 溶液A的制备 S原液 S10 S20 S40 S80 S160 S320,3.6ml W,3.6ml W,0.5ml,0.4ml,0.5ml W,3.6ml W,0.4ml,1.4ml,0.4ml,1.4ml,1.4ml,1ml,1.4ml,1.4ml W,1ml W,1.4ml W,1.4ml W,1.4ml W,溶液C: E 2 ,溶液A,2007-9-1

24、0,Bitab,45,溶液B的制备 E1 E1 E1 S20 E0.5 S40 E0.5 S80 E0.5 S10 S20 S40 E1 E1 S160 E0.5 S320 E0.5 S80 S160 注意事项：制备溶液C和B时，每一步的混合液需在旋涡混合器上混合至少30秒,0.5ml,0.5ml,0.5ml,0.5ml,0.5ml,0.5ml,0.5ml,0.5ml,0.5ml,0.5ml,2007-9-10,Bitab,46,（5）加样及反应 用移液器准确吸取0.1mlBET水将鲎试剂复溶 取0.1ml相应溶液C、B、A加入鲎试剂反应管，每浓度平行2管 另外取0.1mlBET水作为阴性对照

25、溶液D加入鲎试剂反应管,2007-9-10,Bitab,47,（4）结果判断,-,-,+,+,-,-,-,-,-,-,-,-,+,+,+,+,+,+,-,-,+,+,-,-,2007-9-10,Bitab,48,-当溶液A、D均为阴性；溶液C均为阳性时，试验有效。 -溶液B系列中，第一个出现阳性结果的浓度即初步将其判断为样品的无干扰浓度。本试验中的样品无干扰浓度为S40,2007-9-10,Bitab,49,5 、干扰试验,- 通过比较鲎试剂与内毒素在水溶液和供试品溶液中反应的差异程度，来确定供试品在该浓度下是否对BET检查有干扰。 - 至少对3批样品进行干扰试验。 1）试验步骤： - 供试品

26、限值的确定。 - 鲎试剂的选择 - 最大有效稀释倍数的确定 - 反应溶液的制备 - 加样及反应 - 结果判断,2007-9-10,Bitab,50,何种情况下要做干扰试验？ 干扰试验是一个验证实验,新品种建立BET方法 鲎试剂的来源改变 鲎试剂的配方、生产工艺改变 供试品的来源改变 供试品的配方、生产工艺改变 试验环境中发生了其它任何有可能影响试验结果的变化,2007-9-10,Bitab,51,（1）供试品限值 - 硫酸庆大霉素，20000U/ml； 药典要求内毒素限值L=0.5EU/1000U （2）试剂选择,2007-9-10,Bitab,52,- 根据干扰初筛试验的结果，供试品在40倍

27、稀释（对应鲎试剂灵敏度为0.25EU/ml）时无干扰。 - 一般不选择第一个出现阳性结果的供试品浓度作干扰试验。本试验我们选择灵敏度为0.125EU/ml的鲎试剂进行干扰验证试验。 （3）最大有效稀释倍数的计算 MVD = cL/ =80（倍） MVD- = 80(倍),20000U/ml X 0.5EU/1000U,0.125EU/ml,2007-9-10,Bitab,53,（4）各反应溶液的制备,2007-9-10,Bitab,54,溶液C的制备,2007-9-10,Bitab,55,溶液A的制备（供试品的稀释）,2007-9-10,Bitab,56,溶液B的制备 E0.5 E0.25 S

28、80 E0.25 S80 E0.125 S40 S40 E0.125 E0.0625 S80 E0.0625 S80 E0.03125 S40 S40,0.5ml,0.5ml,0.5ml,0.5ml,0.5ml,0.5ml,0.5ml,0.5ml,2007-9-10,Bitab,57,（5）加样及反应,S80 E0.25 （S80E2）,0.25EU/ml （2）,0.125EU/ml （）,0.06EU/ml （1/2）,BET水,0.03EU/ml （1/4）,S80 E0.125 （S80E）,S80 E0.06 （S80E1/2）,S80 E0.03 （S80E1/4）,S80,200

29、7-9-10,Bitab,58,- 36支鲎试剂，先用0.1mlBET复溶，再加相应的溶液0.1ml - 37 1 反应60 2分钟 （6）结果判断,2007-9-10,Bitab,59,反应结果,+,+,+,+,+,-,+,-,-,+,-,+,+,+,-,-,-,-,+,+,+,+,+,+,+,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,2007-9-10,Bitab,60,结果计算及判断,Es=lg-1（Xs/4）=lg-1=0.125EU/ml Et=lg-1（Xt/4）=lg-1 =0.104EU/ml Es 、Et分别为系列C和B的反应终点浓度的几何平均值。 Xs、Xt分别为系列C和

30、B的反应终点浓度的对数值（lg）。,(lg0.125) x4,4,(lg0.06)+(lg0.125) x4,4,2007-9-10,Bitab,61,结论：使用灵敏度=0.125EU/ml的鲎试剂对样品（S）的80倍稀释液（S80）作BET，无干扰。,当溶液A和溶液D（阴性对照）的所有平行管都为阴性，且0.5 Es 2时，试验有效。 当 0.5 Es Et 2.0 Es时，供试品在该浓度下对检查无干扰。 本试验： 0.5=0.06， 2=0.25 Es=0.125， 0.5 Es 2，有效 0.5 Es=0.06 ， 2 Es=0.25 Et =0.104，0.5Es Et 2.0 Es，无

31、干扰,药典规定：,2007-9-10,Bitab,62,6、 检查法 1）凝胶法限量试验,（1）反应设置：,2007-9-10,Bitab,63,（2）试剂选择,- 根据干扰试验结果，供试品在80倍稀释，使用鲎试剂灵敏度为0.125EU/ml条件下，对BET无干扰 - 本试验选择TAL灵敏度为0.125EU/ml,供试品稀释80倍检查,2007-9-10,Bitab,64,溶液C的制备 E100 E10 E1 E0.5 E0.25 溶液A的制备 S原液 S10 S40 S80 溶液B的制备,2.7ml W,3.6ml W,1.6ml,0.4ml,1.6ml W,3.6ml W,0.4ml,0.

32、6ml,0.3ml,0.6ml,1.8ml W,0.6ml W,溶液C,溶液A,0.6ml,0.6ml w,E0.5,S40,S80E0.25,0.6ml,0.6ml,溶液B,(3)各反应溶液制备,2007-9-10,Bitab,65,（4）加样及反应,试管封口 混合 孵育（37/ 602分钟）,8支鲎试剂，先加0.1mlBET水复溶，再加入相应溶液（如图）,2007-9-10,Bitab,66,(5)结果判断,2007-9-10,Bitab,67,举例：注射用头孢拉定的内毒素日常检查,2007-9-10,Bitab,68,1） 参数确定: 供试品的内毒素限值L： 中国药典上规定注射用头孢拉定

33、的内毒素限值L为0.2EU/mg。 鲎试剂灵敏度的选择 根据干扰试验的结果，可选择灵敏度为0.125EU/ml的TAL对注射用头孢拉定按最大有效稀释倍数(MVD)进行日常检查。 MVD计算:加5ml BET水溶解一支供试品,得浓度C=100mg/ml的供试液。,2007-9-10,Bitab,69,2） 制备供试液: 供试品溶液（A）的制备,0.4ml,100mg/ml,头孢拉定,5.0ml,BET水,1:80,1:10,0.5ml,3.6ml,3.5ml,1.0ml,1.0ml,1:160,2007-9-10,Bitab,70, 内毒素溶液（C）的制备,2007-9-10,Bitab,71,

34、 含2内毒素的供试液（B）的制备,1:160 （ 0.625mg /ml） 2CSE（0.25EU/ml）,E0.5 1.0ml,注射用头孢拉定稀释液 1.0ml 1:80,2007-9-10,Bitab,72, 加样反应,试管封口 混合 孵育（37/602分钟）,2007-9-10,Bitab,73,2. 凝胶法半定量试验 应用举例,2007-9-10,Bitab,74,1. 供试品及试剂 1.1 供试品(S):葡萄糖氯化钠注射液， 内毒素限值 L=0.5EU/mL 1.2 TAL：=0.06EU/mL 1.3 CSE 1.4 检查用水（W）,2007-9-10,Bitab,75,2. 凝胶半定量试验溶液的制备,注：A为不超过MVD并且通过干扰实验的供试品溶液，从通过干扰试验的稀释倍数 开始用检查用水稀释成1倍，2倍，4倍，8倍，最后的稀释倍数不得超过MVD。 B为2浓度标准内毒素的溶液A（供试品阳性对照） C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列 D为阴性对照,2007-9-10,Bitab,76,3. C溶液的制备 3.1 用W复溶CSE 3.2 用W把CSE稀释成如下系列浓度溶液：E0.125, E0.06, E0.0