蛋白质分离纯化与结构分析

1、,第五节 蛋白质的分离纯化与结构分析 The Separation and Purification and Structure Analysis of Protein,一、蛋白质的提取 1. 材料的选择 2. 组织细胞的粉碎 3. 蛋白质的提取,1. 材料的选择 微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选 用的材料主要依据实验目的来确定。 对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期 ，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量,2. 组织细胞的粉碎, 1. 高速组织捣碎：, 2. 玻璃匀浆器匀浆：, 3. 超声波处理法：此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备,各种酶，常选用50-10

2、0毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。对超声波敏感和核酸应慎用。, 4. 反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次,，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使 细胞结构破碎。, 5. 化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基,磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。,超声波细胞破碎仪,3. 蛋白质的分离纯化 一、蛋白质（包括酶）的提取 大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液 少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等

3、有机溶剂中 因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及 酶。,（一）水溶液提取法 稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。 提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。 为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂 （如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。, 1.pH值 蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取

4、液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化. 一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋 白质用偏碱性的提取液。 2.盐浓度 稀浓度可促进蛋白质的溶解，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以0.15mol/L浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。,（二）有机溶剂提取法 v一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙

5、醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。 v须在低温下操作 v丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越： 1. 因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强； 2. 丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为6.6%）不 会引起酶的变性失活。 3. 丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生 物材料。,二、蛋白质的分离纯化 （一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法 （二）根据蛋白质分子大小的差别的分离方法 （三）根据蛋白质带电性质进行分离,（一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法,1. 蛋白质的盐析,中性盐对蛋白质的

6、溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶； 当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。 盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。,丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀是常用的蛋白质沉淀方法 使用丙酮沉淀时，必须在04低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶

7、液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。 盐析(salt precipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉 淀。,影响盐析的因素： （1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶解度低。但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低，更容易盐析。 （2）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最 低。 （3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。因

8、此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2.5-3.0%。 蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。 其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25度时饱和溶液为4.1M，即767克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。, 2. 等电点沉淀法,蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但

9、此法很少单独使用，可与盐析法结合用。, 3. 低温有机溶剂沉淀法,用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。, 4. 低温沉淀,（二）根据蛋白质分子大小的差别的分离方法, 1. 密度梯度离心,用超离心机对小分子物质溶液，长时间加一个离心力场达到沉降平衡，在沉降池内从液面到底部出现一定的密度梯度。若在该溶液里加入少量大分子溶液，则溶液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降，比溶剂密度小的部分就会上浮，最后在离心力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子带状物。利用这种现象，测定核酸或蛋白质等的浮游密度，或根据其差别进行分

10、析的一种沉降平衡法。 原理：不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。, 2. 透析与超滤,n 透析(dialysis) 利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合 物分开的方法。 n 超滤法 应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。,3. 应用相分配或亲和原理可将蛋白质进行层析分离 n 层析(chromatography)分离蛋白质的原理 待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并

11、以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。,n 蛋白质分离常用的层析方法 离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。 凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同分离。,（三）根据蛋白质带电性质进行分离 蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同，可将其 分开。,1. 电泳法,各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电 场中的迁移率不同而得以分开。 蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为电泳(elctrophoresis) 。 根据支

12、撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。,n 几种重要的蛋白质电泳: SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。 等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分 离蛋白质的电泳方法。 双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术。 免疫电泳，把电泳和抗原与抗体反应的特异性相结合，常用于蛋白质的鉴定和纯度的检查。, 值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。,2. 离子交换层析法,离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素 ；C

13、M-纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素），当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。,（四）根据配体特异性的分离方法亲和色谱法 亲和层析法（aflinity chromatography）是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand）的分子能特异而非共价地结合。 基本原理：蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不

14、同的蛋白质，因此蛋白质的分离（Separation），提纯（Purification）和鉴定（Characterization）是生物化学中的重要的一部分，至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来，因此往往采取几种方法联合使用。,三.蛋白质的鉴定与含量分析 （一）化学分析法,1. 纯度鉴定,2. 分子量测定,3. 等电点测定,4. 氨基酸分析,5. 序列分析,应用化学或反向遗传学方法可分析多肽链的氨基酸序列 分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成 测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基 把肽链水解成片段，分别进行分析 测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用

15、Edman降解法 一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然 后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。,n 通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列 分离编码蛋白质的基因 测定DNA序列 排列出mRNA序列 按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列,n 根据蛋白质的氨基酸序列预测其三维空间结构： 同源模建：将待研究的序列与已知结构的同源蛋白质序列对齐补偿氨基酸替补、插入和缺失通过模建和能量优化计算，产生目标序列三维结构。序列相似性越高，预测的模型也越准确。 折叠识别：通过预测二级结构、预测折叠方式和参考其它蛋白的空间结构，从而产生目标序列的三维结构。 从无到有：根据单个氨基酸形

16、成二级结构的倾向，加上各种作用力力场信息，直接产生目标序列三维结构。,（二）物理分析法： 质谱法：测定多肽与蛋白质的分子量和氨基酸序列 X射线晶体衍射和核磁共振 圆二色光谱,n三级结构测定 X射线衍射法(X-ray diffraction)和核磁,共振技术(nuclear magnetic resonance,NMR)是研究蛋白质三维空间结构最准确的方法。,n二级结构测定 通常采用圆二色光谱(circular,dichroism，CD),测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量。 -螺旋的,CD峰有222nm处的负峰、208nm处的负峰和198 nm处,的正峰三个成分；而-折叠的CD谱不很固定。,（

17、三）蛋白质含量测定 1. 凯氏定氮法(Kjedahl法) 2. 福林-酚试剂法(Lowry法) 3. 双缩脲法 4. 紫外分光光度法 5. BCA比色法 6. Bradford蛋白分析法,1. 凯氏定氮法(Kjedahl法) 凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方 法。即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气蒸馏出来并为过量的硼酸液吸收，再以标准盐酸滴定，就可计算出样品中的氮量。由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方 法。,2. 福林-酚试剂法(Lowry法) 此法的显色原理与双缩脲

18、方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。 这两种显色反应产生深兰色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。 Folin酚试剂中的磷钼酸盐磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色。在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比。 优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多 缺点是费时间较长，要精确控制操作时间,4. 紫外分光光度法 紫外-可见分光光度法：是根据物质分子对波长为200- 760nm这一范围的电磁波的吸收特性所建立起来的一种定性、定量和结构分析方法。操作简单、准确度高、重现性好。波长长（频率小）的光线能量

19、小，波长短（频率大）的光线能量大。分光光度测量是关于物质分子对不同波长和特定波长处的辐射吸收程度的测量。,5. BCA比色法 Bicinchoninic acid (BCA )法是近来广为应用的蛋白定量方法。其原理与Lowery法蛋白定量相似，即在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。BCA与 Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562 nM处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。 与Lowery法相比，BCA蛋白测定方法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的颜色复 合物稳定性俱佳，并且受干扰物质影响小。 与Bradford法相比，BCA法的显著优点是不受去垢剂的影 响。,6. Bradford蛋白分析法 1976年Bradford建立了用考马斯亮蓝G250与蛋白质结合的原理，迅速、敏感的定量测定蛋白质的方法。染料与蛋白质结合后引起染料最大光吸收的改变，从465nm变为595nm，光吸收增加。 蛋白质-染料复合物具有高的消光系数，因此大大提高了蛋 白质测定的灵敏度，最低检出量为1g蛋白。 染料与蛋白质的结合是很迅速的过程，大约需2min，结合物的颜色在1h内是稳定的。一些阳离子，如K+，Na+，Mg2+，(NH 4 ) 2 SO 4，乙醇等物质不干扰测定，