微生物遗传学课件

1、基因组的精密工程TALE核酸酶介导的基因组编辑技术TALENs的研究进展及应用,生物工程 汇报人：张瑶,TALENs中文名是转录激活因子样效应物核酸酶，TALENs是一种可靶向特异DNA序列的酶，它借助于TAL效应子一种由植物细菌分泌的天然蛋白来识别特异性DNA碱基对。TAL效应子可被设计识别和结合所有的目的DNA序列。对TAL效应子附加一个核酸酶就生成了TALENs。TAL效应核酸酶可与DNA结合并在特异位点对DNA链进行切割，从而导入新的遗传物质。,简介,原理,TALENs充分利用植物病原菌黄单胞菌(Xanthomonas)自然分泌的蛋白-即激活因子样效应物(TAL effectors,

2、TALEs)-的功能：该蛋白能够识别特异性DNA碱基对。人们可以设计一串合适的TALEs来识别和结合到任何特定序列，如果再附加一个在特定位点切断DNA双链的核酸酶，就可以构建出TALEN，利用这种TALEN就可以在细胞基因组中引入新的遗传物质。相对锌指核酸酶(zinc-finger nuclease, ZFN)而言，TALEN能够靶向更长的基因序列，而且也更容易构建。,TALENs技术路线图,TALEs 结构与TALENs,TALEs 具有特殊的结构特征，包括N 端分泌信号、中央的DNA 结合域、1 个核定位信号和C 端的激活域( Fig 1A) 通过对目前发现的所有TALEs蛋白分析发现，T

3、ALEs 蛋白中DNA 结合域有1 个共同的特点，不同的TALEs 蛋白的DNA 结合域是由数目不同的( 12 30 ) 、高度保守的重复单元组成，每个重复单元含有33 35 个氨基酸 这些重复单元的氨基酸组成相当保守，除了第12 和13 位氨基酸可变外，其它氨基酸都是相同的，这两个可变氨基酸被称为重复序列可变的双氨基酸残基( repeatvariable di-residues，RVD) ( Fig 1B ) TALEs 识别DNA 的机制在于每个重复序列的2 个RVD 可以特异识别DNA 的4 个碱基中的1 个，目前发现的RVD 共有5 种 统计分析发现，HD( 氨基酸名称) 特异识别C

4、碱基，NI ( 氨基酸名称) 识别A 碱基，NN( 氨基酸名称) 识别G 或A 碱基，NG( 氨基酸名称)识别T 碱基，NS( 氨基酸名称) 可以识别A、T、G、C中的任一种( Fig 1C) 通过对天然TALE 的研究发现，TALEs 蛋白框架固定识别1 个T 碱基，所以靶序列总是以T 碱基开始。 自然界中，不同TALEs 的DNA 结合域的氨基酸重复序列数目不同，因此，其结合靶DNA 的碱基数目也不同 TALEs 蛋白的这一特点可以用来设计基因组修饰的操作工具，理论上可以根据实验目的对DNA 结合域的重复序列进行设计，得到特异识别任意序列靶位点的TALEs，因而通过对TALEs 重复序列进

5、行人工设计并将其与一些功能域融合产生的dTALEs ( designer TALE-type transcription factors) 和TALENs( TALE nucleases ) 引起了人们极大的兴趣5，6 这些功能域包括激活子、抑制子、核酸酶、甲基化酶和整合酶等7-9 TALEs 的DNA 结合域与FokI 核酸内切酶的切割域融合，就产生了能够在特定位点产生双链断裂( double strand break，DSB) 的嵌合酶TALENs,Fig 1 Structure and base sequence recognition of TALEN,注: NLS 为核定位信号; A

6、D 为转录激活结构域; VD 为重复可变双残基 图1 将转录激活样效应因子蛋白构建成转录激活样效应因子蛋白核酸酶示意图,TALENs 基因敲除原理,TALENs 的DNA 结合域与靶序列结合后，FokI形成二聚体特异性切割DNA 序列，导致细胞中发生的DNA 双链断裂。NHEJ 途径和同源重组( homologous recombination，H) 途径在理论上都可以用于对感兴趣的目的基因进行遗传改造。NHEJ是一种较为简单的修复方式，但是保真度不高，很容易造成DNA 断裂处的序列发生改变，产生DNA的小片段插入和/或缺失( indel) ，进而造成基因突变。在存在同源序列的情况下，细胞还可

7、以通过H 的方式进行修复，不过效率相对较低( 见图2) 。,注: TALENs 为转录激活因子样效应物核酸酶; Left TALENs 为识别突变位点3上游DNA 序列TALENs 质粒;Right TALENs 为识别突变位点5 下游DNA 序列TALENs 质粒;NHEJ为非同源末端连接; HR为同源重组 图2 细胞通过同源重组的方式修复示意图,TALENs 的构建方法研究,设计和构建TALENs 的最大挑战是如何把这些能够结合靶DNA 的重复序列( RVD) 组装起来 目前，基于Golden gate 方法发展了几种组装不同重复个数TALENs 的方法3，16，17 Golden gat

8、e 方法的核心是应用IIs 型DNA 内切酶在识别位点以外对DNA 进行切割，从而达到将多个DNA 片段连接起来的目的( Fig 3),Fig 3 DNA shuffling strategy by using type IIs restriction enzymes Bsa,Two DNA ends terminated by the same 4 nucleotides ( sequence f，composed of nucleotides 1234) flanked by a Bsa recognition sequence，B，form two complementary DNA o

9、verhangs after digestion with Bsa 18,我们实验室经过反复尝试，并结合已经报道的方法，总结了一套可以特异结合靶位点、实现基因组定点修饰、比较简单实用的TALENs 的构建方案( Fig 4),Fig 4 Construction of designed TALENs,The main steps to construct a designed TALEN were present The steps surrounded by broken lines are Golden gate cloning strategy,基因组编辑技术在模式动物中的应用,基因组编

10、辑技术作为靶向修饰方式已经成功应用到生物学研究的模式动物中，包括斑马鱼，大鼠，小鼠，果蝇，秀丽线虫和多种其他物种，包括蝴蝶，青蛙和牛。TALSNs 也已被应用于研究比较相关物种的基因功能。这一应用为研究较近物种的相似性和不同点，以及可能的同源性基因对的分析提供了巨大便利 研究者通过微注射TALENs mNA 和单链DNA寡链核苷酸或带有延长( 800 bp) 同源臂的供体质粒至单细胞胚胎39-40，最终实现斑马鱼中loxP 染色体整合，为此模式动物的传统基因激活提供了可能性。除了有价值的动物模型，TALENs 已经应用于改造植物表型，包括拟南芥和若干种类玉米，最终将像耐病和耐旱特性整合入植物4

11、1-43。这些基因组编辑技术修饰的生物将毫无疑问的生长，进一步扩大基础研究和基因组生物学的内容,江苏省医药动物实验基地转基因中心基于TALENS和锌酯酶ZNF技术建立了快速体细胞基因重组和小鼠敲除技术，可在3个月内获得基因敲出小鼠或是体细胞重组克隆,基因组编辑技术转染至细胞的方法,虽然基因组编辑技术可以实现靶位点的基因突变，但是这项技术仍然受到将这些酶有效转染进入相关细胞的限制。例如，核酸酶编码基因可通过质粒DNA，病毒载体或体外转录的mNA 形式进入相关细胞。这些转染方法可以根据细胞类型或应用性进行修改。但是，病毒和非病毒基因的基因转染系统限制基因组编辑技术的可能应用。尤其是，质粒DNA 或

12、mNA 的电转染或脂质体转染对于某些细胞是有毒性且限制性。病毒载体也具有一定的限制性，因为它们是复杂的，产量低，潜在的免疫原性和调节阻碍。尽管有以上缺点，基于腺病毒介导ZFNs基因转染至T 细胞的临床实验正在开展，但是未来,科研工作者将努力改善转染方法。 整合酶缺陷慢病毒是一种将锌指核酶转染至难转染细胞类型的有效替代方式。但是，这一方法似乎不适用于高度重复性TALENs 序列44。尽管与ZFNs 相比，TALENs 的合成较简单，但是其较难转染至细胞。腺病毒载体的转染是ZFNs 的有效转染方式，并可以增加ZFNs 介导HD 效率和增强体内ZFNs 介导的基因校正45-47。腺相关病毒有效包装只

13、适用于长度小于4 2 kb 的片段。虽然这只适用于ZFNs 单体和编辑供体结构，但是单一带有小启动子的TALENs 单体可以插入这一载体。,中科院，港中大PNAS基因编辑研究新成果一种快速组装基因编辑分子TALEN的方法校转基因中心对外提供锌酯酶和TALENS基因敲除服务,基因组编辑技术的进步,为了使核酸酶可以应用到基因分析和临床应用方面，科研工作者需要证明此核酸酶可以严格结合至DNA 靶位点。但是，因为复杂的基因组往往含有与靶位点相似或高度同源序列，从而导致脱靶活性和细胞毒性。为解决这一问题，基于结构和选择的方法被用来改善TALENs 异二聚体结合，同时具有良好的剪切特异性和较小毒性48-5

14、1。目前，人们已经成功改进了FokI 切割结构域即Sharkey，与以往的ZFNs 比较，切割活性高15 倍。,其他基因组编辑技术-转座酶、重组酶和转录因子,近年来，人们对基因组编辑技术认识不断加深，应用日渐扩展，已经应用于细胞和生物体的基因修饰。但是，靶向核酸酶的若干限制性( 如，基因组编辑技术的脱靶效应对于细胞的毒性的预测和检测的复杂) 正在促进基因组编辑技术的程序酶的替代研究发展。此外，因为靶向核酸酶依赖NHEJ 和HD诱导基因突变，在特殊的细胞类型中可能限制了DNA 修复机制的实现。为解决这一问题，锌指蛋白和TALEs 与酶切结构域结合，其中包括位点特异性重组酶，转座酶,从而催化DNA

15、 整合、缺失和插入。因为这些酶自动实现DNA 切割和再连接，所以潜在的有毒性DNA 的双链断裂不会在基因组中聚集。此外，在应用方面，人们往往希望可以靶向插入基因，重组酶和转座酶活性是以供体DNA 插入至基因组为标志，因此脱靶效应可以直接检测。再者，转座酶和重组酶的机制不依赖细胞DNA 修复途径。因此，这些方法几乎适用于所有细胞和细胞生长阶段。这些过程的有效性也可以直接进化改善，但是，重组酶和转座酶若要具有基因组编辑技术的功能，它们需要改善其灵活性和效率，尤其，在重组酶催化结构域保持其识别序列特异性，从而保证与靶位点特异结合，减少细胞毒性方面; 同样，虽然转座酶融合证明在其靶位点具有高活性，这些

16、合成蛋白也有显著的脱靶危险。,基因组编辑技术的临床应用,基因组编辑技术在疾病治疗中的应用代表基因治疗的巨大进步。与传统治疗不同，ZFNs 和TALENs可以通过精确的基因修饰，彻底治愈疾病的病因。目前，ZFN-诱导的同源定向修复已应用于X 连锁严重联合免疫缺陷症，B 型血友病，镰刀细胞病和1-抗胰蛋白酶缺乏的基因缺陷校正。在体外实验中，ZFNs可以纠正帕金森病患者iPS 细胞SNCA 基因突变。经ZFN-诱导NHEJ 介导修复是攻克HIV/AIDs 的重要策略。ZNFs 可通过破坏原代T 细胞和造血干细胞/祖细胞的CC5 基因实现HIV-1 的抗性HIV 并已经进入临床实验阶段( NCT012

17、52641，NCT00842634 和NCT01044654) 。基因组编辑技术可以安全地插入治疗性转基因至人类基因组的特异性安全位点。虽然基因组编辑技术的应用限制在体细胞，但是在包括诱导多能干细胞( inducible pluripotent stem cells，iPSCs) 的干细胞研究中也取得了一定进展。这终将为包括自体干细胞移植的基因治疗奠定重要基础.,TALENs是近年来发展迅速的编辑基因,TALENs作为一种全新的基因组编辑工具，近年来引起了人们的极大兴趣。与ZFN相比，它更便宜，更高效，脱靶率低。利用这种技术，研究人员已经开发出多种疾病的动物模型，有助于疾病的分子机制研究。 在

18、研发TALENs技术过程中，科研人员发现来自植物病原菌Xanthomonas中的TAL蛋白核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有较恒定的对应关系。利用此恒定对应关系，构建与核酸内切酶的融合蛋白，在特异位点打断目标基因组DNA序列，从而可在该位点进行DNA编辑修饰操作，比如knock-out、knock-in、碱基替换、点突变或者基因修饰等。该技术能识别任意目标基因序列，不受上下游序列影响等问题，因此使得基因操作更加简单方便。,科学家首次用TALENs技术编辑线粒体基因,迈阿密大学米勒医学院的研究人员利用TAlENs技术首次清除线粒体内的突变DNA，以使得突变的线粒体DNA下降了，这项研究

19、有望用于治疗母系遗传的线粒体病。研究成果发表在Nature Medicine上 线粒体病通常是由突变的线粒体DNA（mtDNA）引起的，在大部分情况下它与野生型mtDNA共同存在，导致mtDNA异质性。常见的线粒体病包括线粒体肌病、线粒体脑病和线粒体脑肌病，如Leber遗传性视神经病（LHON）。这种疾病的主要症状为视神经退行性病变，在男性中较多见。,TALENs清除突变的线粒体基因,在这项研究中，迈阿密大学米勒医学院的研究人员探索了转录激活因子样（TAL）效应物，同时在寻找修复线粒体基因缺陷的新策略。他们尝试了TAL效应物核酸酶（TALENs）这种基因编辑的新方法。 研究人员在实验室中使用细

20、胞来设计线粒体靶向的TALENs（mitoTALENs），来结合并切割线粒体DNA，正是这段基因中的一个突变引起了LHON。他们随后检测了mitoTALENs是否清除了mtDNA。分析结果表明，细胞中总的mtDNA暂时下降，这是由于突变mtDNA的下降。 文章的通讯作者，神经和细胞生物学教授Carlos T. Moraes博士表示：“一旦mitoTALENs与特定靶点的DNA结合并切割，突变的mtDNA就被降解。总的mtDNA的下降刺激细胞通过复制未受影响的分子来增加其mtDNA。两周之后，mtDNA水平恢复正常。但由于突变的mtDNA被破坏，细胞中大部分为正常的mtDNA。” Moraes博

21、士提到，清除细胞中的大部分但并非全部突变mtDNA已足以治疗多种线粒体病，因为只有当突变mtDNA占了80%以上时，它才会引起疾病的症状。研究人员计划下一步在动物中检验这种方法。,2 0 12年，来自明尼苏达州罗切斯特梅奥医学中心的分子生物学家斯蒂芬艾克尔领导的研究人员，第一次利用T A L E N s 切割斑马鱼一段基因序列中的部分DNA，并用合成D N A 取代它们。斑马鱼是脊椎动物生物学和人类疾病研究的一个重要的参与者。其胚胎透明、体外受精、短繁殖周期和快速生长等特点，意味着可对活体动物开展紧密的胚胎发育研究，可作为研究基因行为和功能的一种有用模型。在遗传组成上，斑马鱼与人类拥有几乎90%的相同性，因此研究它们的发育能够有助于认识人类疾病。在早期的胚胎发育阶段，这尤其如此。这项研究发表在2012年9月23日出版的英国自然杂志上。,转录激活因子样效应物核酸酶主要构建能特异性识别DNA序列的核酸内切酶。该酶由两部分组成： DNA结合区域和核酸酶催化区域。激活因子样效应物主要是识别靶基因的特定DNA序列，核酸