免疫功能检查课件

1、免疫功能检查 Laboratory Diagnosis for Immune Function 第二军医大学附属长征医院全军医学免疫中心高春芳,临床疾病与免疫的关系 免疫系统性疾病 免疫缺陷病、免疫增殖病 免疫相关性疾病 自身免疫性疾病、变态反应性疾病 感染性疾病 应用免疫学技术诊断、治疗性疾病,临床免疫 自身免疫病 内分泌免疫学 变态反应性疾病 皮肤病免疫学 免疫缺陷性疾病 免疫增殖性疾病 心血管病免疫学 呼吸免疫学 移植免疫学 生殖免疫学 肿瘤免疫学 神经免疫学 传染免疫学 消化免疫学 风湿病学 血液免疫学 创伤免疫学 免疫治疗学 肾病免疫学 免疫预防学,免疫学诊断的定义： 用抗原、抗体结

2、合的技术对与免疫有关的疾病，如免疫增殖病、免疫缺陷病、变态反应、自身免疫、传染病、恶性肿瘤等作出辅助诊断或特异性诊断。 应用意义：1. 直接测定免疫功能 2. 检查致病因子 3. 参考作用,免疫功能 (immune function) 体液免疫 (humoral immunity) 细胞免疫(cellular immunity) 免疫球蛋白(immunoglobulin) T细胞 (T-cell) 补体(complement) 细胞因子(cytokines),两种T辅助细胞不同的细胞因子产生谱 及不同效应,体液免疫测定 免疫球蛋白定量 散射及浊度测定技术 原理是根据抗原和抗体形成的复合物粒子对

3、光的散射和吸收度来判断待测抗原的量。测定散射光强度的方法称为nephelometry，测定吸收光强度的方法称turbidimetry。两种方法均可采用速率法（rate assay）即反应开始第1分钟内的光散射或吸收度或终点法（end-point assay），即反应终止时（一般为30min）的光散射度或吸收总量。通过微电脑对数据进行处理，即可知道被检蛋白质（Ig）的含量 参考值： IgG 815 g/L, IgA 0.93 g/L, IgM 0.52.5 g/L,免疫球蛋白测定的临床意义 免疫球蛋白升高 非特异性多克隆升高 特异性单克隆升高 免疫球蛋白减低 细胞免疫缺陷、体液免疫缺陷、联合免疫

4、缺陷 免疫球蛋白缺陷病：无球蛋白血症、选择性IgA 缺陷症、选择性IgM或IgE缺陷,Recombination -22;H-14) 轻链、重链的基因不连续，必须经过基因重排分别连在一起。 同样按照DNAmRNA蛋白质这一生物合成的中心法则合成。 重链、轻链分别在不同的核糖体( polysomes)上合成。 合成后的轻链和重链在光面内质网装配成完整的Ig分子(H2L2)。 装配好的Ig分子进入高尔基氏体进行糖基化，通过分泌泡送至细胞膜表面, 在释放前可在细胞膜表面停留几个小时。,H链和L链的氨基酸数量差别很大,合成的速度也不同,一般合成一条重链约需18分钟,而合成一条轻链只需10分钟, 组成一

5、条完整的Ig(两条重链和两条轻链)则有一条以上轻链过剩。多余、过剩的轻链由细胞膜分泌到胞外, 再转入肾脏, 约10在肾小管内分解代谢, 80回吸收,由体内巨噬细胞吞噬降解，10从尿排出。因此, 正常人尿中始终有微量轻链排出。正常人尿约含510g/ml, 最大20g/ml, 每天约排25mg/d。因为是正常合成, /也是2:1。这个含量用一般方法是无法测出的。,非特异性免疫球蛋白增殖病 肝病 自身免疫病 慢性感染 恶性肿瘤 免疫母细胞淋巴结病 AIDS,免疫指标不是肝功能的直接指标，但由于肝脏承担了体内蛋白质的及其它物质的合成与代谢，因此能直接或间接地影响与调节机体的免疫状态，通过对血清Ig及补

6、体的检测，可在一定程度上反映受检者肝脏的疾病和损伤。,血清蛋白电泳,肝病是导致外周血免疫球蛋白非特异性升高的六大病种之一。 急性肝炎多以IgM升高（310天）。 慢性肝炎IgG、IgA皆升高，以IgG为主。 肝硬化则IgG、IgA、IgM皆升高，但以 IgA升高为显著。 肝癌则IgM降低、IgA升高最明显。 当然以上这些变化是相对而言，并不是绝对的。,肝脏不是免疫球蛋白的合成场所，但对血清中免疫球蛋白含量起重要的调节作用，这种调节作用表现在： 影响肠道内抗原物质的吸收及处理; 通过Kupffer细胞对抗原呈现特殊递呈作用; 门体静脉侧枝循环可将肠道来源的抗原直接 暴露在全身免疫系统而诱导机体大

7、量抗体的产 生等。,特异性免疫球蛋白增殖症 (单克隆增殖和恶性Ig增殖症) 单克隆增殖是一个细胞在某一分裂阶段发生突变, 然后急剧分化、增殖, 并大量表达某种单一的Ig, 这种恶性增殖具有如下特点: 均一型 含量大(达到数克也可高达10余克) 正常成分减少(正常值以下) 比例失调(/或2:1) 出现相关临床表现(骨骼、肾脏、血液等系统),当Ig异常表达时, 可出现以下三个现象: 被激活、突变的B细胞转化为前B细胞或浆细胞活性极高,可快速合成Ig, 合成一条H链大约需要2.5分钟, 合成一条L链则只需1分钟。如此, 每合成一分子Ig则会剩余3条轻链,多余的轻链由尿中排出, 可达1mg/ml以上。

8、 由于突变和激活的细胞是单一克隆, 按一个细胞一种抗体的原则, 所表达的Ig均为单一产物, 亦即一个型、一个亚型、一个基因型。因此, 尿中出现的过剩轻链均属一个型。同样, 血中增殖的Ig, 多属一个型。血和尿中/决不是2:1或大于此或小于此。 由于同种抑制和反馈抑制, 当某一克隆细胞大量、快速增殖时, 其他克隆细胞则会被抑制, 大量的均一产物(Ig)也会反馈地抑制正常克隆的增殖和表达。因此, 除单一克隆产物大量增殖外, 正常Ig则会明显减少。,多发性骨髓瘤: 发病机率和Ig含量一样, IgG型最多, IgA型次之, IgM型少见(7S),IgD更少, IgE型罕见(至今发现不过20例)。 巨球

9、蛋白血症: 属于IgM型, 由于大量增殖, IgM可发生各种聚合, 正常为19S, 患者可出现24S, 32S等多钟聚合体。 淋巴瘤: 有时慢性淋巴细胞恶性病变, 也可出现多克隆增殖。,轻链病 可分型和型, 亦有双克隆型。由于尿中出现轻链可分多克隆型、单克隆型, 并随型在诊断中要分析清楚。轻链病的诊断必须符合以下三条才能作出决定: 各种Ig正常或减少; 血中和尿中出现一条轻链带(电泳后) 临床上符合一个多发性骨髓瘤的诊断 重链病: Ig有5种重链则应有5种重链病, 但目前只发现了4种, 最多的是重链病, 已发现200余例, 重链病已报告, 重链病只有19例, 重链病只有一例报告,重链病至今未见

10、报告。,7S IgM病: IgM是19S, 7S是小分子IgM报告不 多, 我国尚未发现。 半分子病: 按机率5种Ig皆可出现半分子病, 但至 今只发现IgG(3例)和IgA(5例)半分子病。除了免疫分析有特点之外, 其他基本上如MM 选择性或链缺乏症: 本病报告极少, BMG(良性M蛋白血症)或MGUS(不明意义的M蛋白症): 属于一种良性异常增殖、性质不良、/值轻度变化, M蛋白3g/dL, 骨髓浆细胞10等。,Four- M character Monoclonal Multiple Myeloma Malignant,Distribution of serum monoclonal p

11、roteins in 922 cases at the Mayo Clinic in 1992,Epidemiology of MM lAnnual incidence: 4 per 100,000, related to the availability of medical facilities; in the elderly and the improvement of diagnostic techniques. l 1% in all malignant diseases, slight more than 10% in hematologic malignancies. lRaci

12、al difference for incidence rate, lower in Asian. l In persons younger than 50yr: 18% l Median age at diagnosis: 63 yr,Multiple Myeloma ( MM) The annual incidence of MM is 4/100,000 per year Il-6 is a major growth factor in MM 99% of patients have a monoclonal protein in the serum or urine during th

13、e course of their disease The most important prognostic factors are plasma cell labeling index and 2 microglobulin level,Biologic Aspects lSurface markers of malignant plasma cells suggests its origin from a pluripotent stem cell. l CD4 T cells: decreased. l IL-1 and TNF devoted to the bone lesions

14、in myeloma. lIL-6: important myeloma cell growth factor for the progression. lOncogenes related: Ras mutation 47%/33 cases; P53 point mutation l Cytogeneic studies: chromosome abnormalities 50%,Clinical manifestations l Bone pain: 2/3 l Height reduce because of vertebral collapse l Weakness and fati

15、gue because of anemia l Fever because of infectious process l Pallor, most frequent physical finding l Liver palpable in 15% patients, spleen rarely enlarged lExtramedullary plasmacytomas: large, purplish, subcutaneous masses observed late in the course of the disease,Laboratory findings L Normocyti

16、c, normochromic anemia 2/3 L Hypercalcemia L Elevation of serum creatinine level L SPE: M-spike 80% L M-protein: 92% IgG 50%; IgA 20%; free monoclonal light chain 20% L Serum or Urine M protein: 99% L Plasma cells: 10% (5100%), more focal than diffuse, repeated bone marrow examination necessary,Help

17、ful laboratory items for differential diagnosis: The size of the serum M-protein; The amount of urine M-protein; The number of bone marrow plasma cells; The hemoglobin, calcium, and creatinin levels and levels of uninvolved serum Igs;,Prognostic factors l Duration of survival: few months many years,

18、 median 2.53 year. l Uncorrected 2 microglobulin level is one of the most powerful prognostic factors l CRP, which correlated with the serum IL-6 level maybe helpful for determining prognosis l LDH, if elevated indicates poor prognosis,单克隆性免疫球蛋白增殖症的实验室诊断要点,免疫球蛋白及轻链定量 血清蛋白电泳 免疫固定电泳 尿蛋白电泳及本周氏蛋白定性,补体检查

19、和有关疾病 总补体活性测定 CH50 单个补体成分定量 C4经典途径 B因子旁路途径 C3经典和旁路途径 临床意义： 补体减少：肾病、自身免疫性疾病、肿瘤、 补体缺陷病。 补体增加：少见，如肿瘤。,Two Typical Pathway for Complement Activation,Common Pathway for complement activation,补体与肝脏的关系较免疫球蛋白更为密切，部分补体及其抑制因子由肝脏合成，肝脏的感染和炎症反应可刺激机体免疫系统，导致血清总补体活性及其它补体成分的含量增加，这种现象可见于预后较好的急性病毒性肝炎早期。 当肝实质受到严重损伤时，补体

20、成分的合成相应减少，这种减少往往在肝病的晚期，同时伴有显著的肝功能受损。 此外任何造成肝实质损伤与肝脏流动力学变化均可导致循环免疫复合物在外周血中的积聚，其结果导致对补体的过量激活，使血清中补体含量消耗性降低，急性降低多见于急性重症肝炎，慢性消耗性减低主要发生在多种补体成分自身免疫性疾病、自身免疫性肝炎、肝硬化及其它原因导致的肝病晚期。,细胞免疫功能测定,抗原特异T细胞检测,细胞毒性T细胞检测,流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是八十年代发展起来的一项利用流式细胞仪进行分析的新技术。流式细胞术集激光术、微电脑、单克隆抗体技术、细胞色素化学于一体，形成了快速、准确的分析和细胞分

21、选技术方法。FCM在临床和基础研究中的价值主要体现于免疫表型分析、DNA含量分析和细胞分选三个方面。其中免疫表型分析在细胞免疫功能测定中起着重要作用。,FCM原理 用细胞表面特异性单克隆抗体与细胞作用，再利用荧光结合的第二抗体与之作用。通过抗原抗体反应，使阳性细胞标上荧光，此为间接标记法或将特异性单抗先标记上荧光再直接与细胞结合发光，此为直接标记法，当细胞流经流式细胞仪，激光束（488nm）对高速通过的细胞流照射，使荧光染料产生不同波长的散射光，光信号收集后经由PMT（光电倍增管）放大并加以分析处理，在短时可获取细胞大小、核质比、荧光强度和阳性百分比等数据。,流式细胞术的几个重要特点 标本只要

22、是单细胞即可用于分析 极短时间内可分析大量细胞 可同时分析单个细胞的多种特征 定性或定量分析,FCM对细胞免疫功能的检测主要用于 1、细胞分群和细胞亚群的分析 利用CD45/CD14可以分出外周血中的白细胞和单核细胞，在白细胞内利用CD3、CD19、CD20、CD3/(CD16+56)+ 等标记进一步可分出T、B淋巴细胞和NK细胞等。在T细胞内又有CD4/CD8标志的T辅助/诱导和T抑制/杀伤亚群利用CD4/CD29、CD8/CD28标志可以将T4、T8进一步分出各亚群。 2、检测淋巴细胞的活化 CD3/HLA-DR、CD3/CD25、CD69等都是活化T淋巴细胞的特异性标记，另有C17单抗是

23、活化的细胞毒T淋巴细胞的标志物。其比值的改变对病情监测，疗效判断有重要的指导意义。 3、一些特殊的标志如CD4/CD8比值是AIDS、自身免疫性疾病病程监测的重要指标。,当前流式细胞分析的发展趋势(1) 从相对细胞计数到绝对细胞计数 淋巴细胞亚群、造血干细胞、网织红细胞、血小板等 从相对定量到绝对定量 定量抗体微球法 定量荧光素分子微球法 从单色到多色荧光分析 特别适用于淋巴细胞亚群分析、白血病免疫表型分析、 细胞功能评价,当前流式细胞分析的发展趋势(2) 从细胞膜成分到细胞内成分分析 胞浆酶、细胞因子等多种成分分析 液体中可溶性成分的流式细胞术分析 流式微球分析 流式分子表型分析 Molecular phenotyping 用流式细胞计数检测细胞中特异性核酸序列或 特异性基因异常。分析表型与免疫表型分析技术相结合，对于分析特定细胞群的功能和特性提供广阔应用前景。,常用外周血表型分析值* CD分类 意 义 正常值（）X2S CD3 总T淋巴细胞 65.869.60 CD2 花环形成细胞 77.469.27 CD4 T辅助/T诱导亚群 37.538.