酵母双杂交试验流程

1、4月4日 划线 配培养基 TE/LIAC PEG/LIAC 配置培养基（YPD YPDA） 取酵母细胞 划线 30 生长3天。需要用品：三角瓶 灭菌封口膜 酵母提取物 蛋白胨 注：以下所有涉及菌的操作均需在超净台中完成。4月6号 星期三（1） 选择2-3mm的单克隆（枪头吸取）放入3-5ml的YPDA液体培养基，30摇菌200rpm，8h7号下午开始，过夜培养，次日若菌液浓度达到标准，可先置于4度冰箱保存。需要用品：200ul灭菌枪头、50ml三角瓶、YPDA液体培养基、摇床。4月7号 星期四（2） 吸取2.5-10ul酵母培养液，加入25ml YPDA液体培养基，摇菌16-20h直到OD值0

2、.15-0.3。下午4点开始 8号 8点结束Tips：由于第一次活化的菌夜浓度不一，此处建议设置梯度，分别取2.5、5、10 ul酵母培养液，加入25ml YPDA液体培养基（转化5个以下质粒的话，25ml菌量就够后续使用）。4月8号 星期五（3） 将菌液转移至灭菌的50ml离心管中，用天平配平后，室温下700g离心5分钟。（4） 弃掉上清，加入50ml新鲜的YPDA液体重悬菌体（由于离心转速较低，沉淀易悬起来，故倒掉上清液时要小心操作）。（5） 30震荡培养，直到OD值达到0.4-0.5 （3-5h）。8号 8点开始 下午一点结束进行以下操作之前，配置好TE/LiAc溶液，并准备好冰浴。（6

3、） 将上述菌液转移至一个灭菌的50ml离心管中，用天平配平后，室温下700g离心5分钟。（7） 弃掉上清，用30ml无菌水重悬菌体（小心操作）。（8） 再次用天平配平后，室温下700g离心5分钟，弃去上清，加入1.5ml 1.1xTE/LIAC重悬菌体。（9） 将上述溶液转移到灭菌的1.5ml EP管中，高速离心15s。（10） 弃去上清，加入600ul 1.1x TE/LIAC，感受态细胞制备完成，置于冰上待用。需要物品：50ml 灭菌离心管、50ml 三角瓶、1.5ml EP管、5ml灭菌枪头、1ml灭菌枪头、灭菌ddH2O、 YPDA液体培养基、1.1x TE/LIAC。1.1x TE/

4、LIAC 10ML10xTE 1.1ml10xliac 1.1mlDh2O 8.8ml 酵母转化进行以下操作之前，配置适量的PEG/LIAC溶液，设置水浴锅。（11） 取适量的CarrierDNA，沸水浴变性5-10min，后立即置于冰水混合物中。（每转一个质粒需准备5ul CarrierDNA，每10个样多准备5ul）（12） 取数支灭菌的1.5ml EP管编号，置于冰水混合物上冷却。（13） 每个EP管中加入5ul变性后的CarrierDNA，再加入5ul待转化的质粒DNA，用枪头混匀。（14） 向每个EP管中再加入50ul感受态细胞，轻敲管壁混匀（不要用枪头吹打）。（15） 向每个EP管

5、中再加入500ul PEG/LIAC溶液，上下颠倒混匀（不要用枪头吹打）。（16） 30水浴30min，每10min拿出来上下颠倒混匀（此过程中倒SD平板）。（17） 向每个EP管中再加入20ul DMSO，上下颠倒混匀（多颠倒几次，充分混匀）。（18） 42水浴15min，每5min拿出来上下颠倒混匀。（19） 高速离心15s，用枪头吸出上清（由于液体粘稠，不能直接倒）（20） 加入1mlYPDA液体培养基，重悬菌体后，高速离心15s。（21） 弃掉上清，加入1ml灭菌的0.9%NaCl溶液重悬菌体。（22） 取100-200ul菌液涂板于相应的SD缺陷培养基上。需要物品：BD质粒（需提前准

6、备）、carrier DNA、PEG/LIAC、DMSO、灭菌1.5mlEP管、YPDA培养基、0.9%无菌NACL、水浴锅、灭菌10ul、200ul、1ml枪头。PEG/LIAC YPDAPEG3350 8ml 20g/l 蛋白胨10X TE 1ml 10g/l 酵母提取物10X LIAC 1ml 0.03g/l 腺嘌呤 20g/l 葡萄糖报告基因的检测1 涂板于缺陷形SD固体培养基30培养直至长出酵母细胞。2 长出酵母细胞后，挑菌至缺陷型SD液体培养基培养（3份）3 摇菌至OD=0.6-1.0 4 高速离心去上清，用无菌水重悬。5 稀释菌液形成4个梯度 1:1 1:10 1:100 1:10