X3-1-1__DNA重组技术的基本工具.ppt

1、1,专题1 基因工程,1.1 DNA重组技术的基本工具,基础理论和技术发展催生了基因工程,科技探索之路,1)基因转移载体的发现 2)工具酶的发现 3)DNA合成和测序技术的发明 4) DNA体外重组的实现 5)重组DNA表达实验的成功 6)第一例转基因动物问世 7)PCR技术的发明,角似鹿 鼻似狮 目似虎 唇似牛 爪似鹰 髭似马 鳞似鱼 身似蛇,设想一,能否培养出具有抗虫 性状的抗虫棉呢？,蓝色玫瑰,能生产胰岛素的大肠杆菌,转基因鼠,能发荧光的转基因猪,9,是指按照人们的意愿，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品

2、。 由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫DNA重组技术或基因拼接技术。,什么叫基因工程？,生长激素、胰岛素,10,基因拼接技术或DNA重组技术,生物体外,基因,DNA分子水平,人类需要的新的生物类型和生物产品（或基因产物）,剪切, 拼接, 导入, 表达,实 质（原理）,基因重组,对基因工程概念的理解,一种定向改造生物的新技术,第1节,12,1.1 DNA重组技术的基本工具,13,基因工程培育抗虫棉的简要过程：,普通棉花(无抗虫特性),苏云金芽孢杆菌,提取,抗虫基因,与载体DNA拼接 导入,棉花细胞(含抗虫基因),棉花植株(有抗虫特性),14,关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆

3、 菌细胞内提取。 关键步骤二：抗虫基因与载体DNA连接。 关键步骤三：抗虫基因进入棉细胞。,基因的分子手术刀限制性内切酶。 基因的分子缝合针DNA连接酶。 基因的分子运输车载体。,如何解决？,抗虫棉培育,阅读课本4-5页“限制性核酸内切酶分子手术刀”的相关内容，填写下表,自主学习一,主要从原核生物中分离纯化而来,已经分离出大约4000种,1、识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列,2、使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。,形成两种末端：黏性末端或平末端,脱氧核苷酸的结构,G,A,3,5-磷酸二酯键,3端,5端,3端,5端,磷酸二酯键,18,仔细观察各限制酶 识别的特定序列有何

4、特点？,限制酶的识别序列,限制酶所识别的序列的特点是：找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 ，称为回文序列,中轴线,在G与A之间切割,大肠杆菌的一种限制酶(EcoR)只能识别GAATTC 序列，并在G和A之间切开。,EcoRI限制酶的作用,黏性末端,黏性末端,EcoRI限制酶的切割,被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,错位切,SmaI只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。,中轴线,SmaI限制酶的作用,在G与C之间切割,平末端平末端,SmaI限制酶的切割,当限制酶从识别序列的中心轴线处切

5、开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。,限制酶作用特点,1、限制酶识别特定的核苷酸序列回文序列,回文序列： 在切割部位，一条链 正向读的碱基顺序与 另一条链反向读的顺 序完全一致。,2、限制酶断开磷酸二酯键,你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？,原核生物（主要是细菌）易受自然界外源DNA（噬菌体DNA）的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。 所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身

6、的目的。,寻根问底,寻根问底,为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？,通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。,26,1、要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？,要切两个切口，产生四个黏性末端。,3、如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？,会产生相同的黏性末端，然后让两者的黏性末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。,2、要把目的

7、基因插入运载体的前提是什么,必须用同一种限制酶来切割目的基因和运载体。,思考?,27,类型,来源,功能,相同点,差别,EcoliDNA连接酶,T4DNA连接酶,大肠杆菌,T4噬菌体,催化形成磷酸二酯键,只能连接黏性末端,能连接黏性末端和 平末端(效率较低),阅读课本第5页“分子缝合针DNA连接酶”的相关内容，填写下表,自主学习二,28,“DNA连接酶”,将两段DNA片段连接,1分类：根据酶的来源不同，可分为EcoliDNA连 接酶和T4DNA连接酶两类 2功能：恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的 磷酸二酯键。 两种DNA连接酶(EcoliDNA连接酶和T4DNA连接酶)的比较： 相同点：都缝

8、合磷酸二酯键 区别：EcoIiDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能 使黏性末端之间连接； T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末 端之间的效率较低。,把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来催化形成磷酸二酯键,DNA连接酶的作用,两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来,DNA连接酶的缝合作用,可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，,注意：DNA连接酶可连接双链DNA中的DNA单链缺口，但不能连接单链DNA！,DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？,T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低,DNA连接酶的缝合作用,A A T T G,C,DNA聚

9、合酶的作用,都能催化形成磷酸二酯键,都是蛋白质,不需要,需要,形成完整的重组DNA分子,形成DNA的一条链,基因工程,DNA复制,DNA连接酶与DNA聚合酶的比较,只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键,在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,34,DNA连接酶的种类,35,36,2个,4个,1、每连接两个相同的黏性未端要连接几个磷酸二酯键？ 2、用限制酶切一个特定基因要切断几个磷酸二酯键？,思考：,2.为什么限制酶和DNA连接酶在微生物中能够分离到,而高等植物和动物中没有?,原核生物容易受到自然界外源DNA的 入侵，但是生物在长期的进化过程中形成 了完善的防御机制，以防止外来病

10、原物的 侵害。 限制性核酸内切酶就是细菌的防御性工 具，当外源DNA侵入时，限制性核酸内切 酶会将外源DNA切割掉，以保证自身的安 全。 所以，限制性核酸内切酶在原核生物中 主要起到切割外源DNA、使之失效，从而 保护自身的作用。,载体的作用,载体的必要条件,载体的种类,阅读课本第6页“分子运输车运载体”的相关内容，填写下表,自主学习三,1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。 2）具多个限制酶切点，以便与外源基因连接。 3）具有某些标记基因，便于进行鉴定和选择。 4）必须是安全的 ，对受体细胞无害。 5）载体DNA 分子应大小适中，以便于提取和操作,1）作为运载工具，将目的基因导入受体细胞中

11、2）在受体细胞内对目的基因进行大量复制,细菌的质粒(由天然的改造而成) 病毒：噬菌体衍生物、动植物病毒等。,39,基因工程的 载体,目的基因,指某些小型DNA分子,能够在宿主细胞中复制并稳定地保存,具有多个限制酶切点（每种限制酶切点最好只有一个）,具有标记基因，便于进行筛选,条件,40,常用的运载体主要有两类： 1）细菌细胞质的质粒 2）噬菌体或某些动植物病毒,有标记基因的存在，可用含青霉素的培养基鉴别。,有切割位点,能复制并带着插入的目的基因一起复制,质粒裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。,最常用运载体质粒,实际上在基因工程操作中，真

12、正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。,42,质粒是染色体外能够进行自主复制的裸露的、结构简单的、双链环状DNA分子。 现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中核以外的DNA分子。,质粒,Plasmids,质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性作用，但复制只能在宿主细胞内完成。,43,大肠杆菌的质粒,最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，其中常含有抗药基因，如四环素、氨苄青霉素的标记基因。 复制的形式： 1、独立自我复制 2、整合到染色体上，随染色体DNA同步复制。,质粒（人工改造的质粒）是基因工程最常用的运载体。,44,外源基因,45,46,例、已知标记基因有抗四环素基因

13、和抗氨苄青霉素的基因，现探讨某细菌的质粒中有无标记基因或标记基因是什么？请设计实验、预期实验结果，并得出相应的实验结论。,对照组：不添加抗生素,实验组1：添加一定浓度的四环素,实验组2：添加一定浓度的氨苄青霉素,实验组3：添加一定浓度的四环素和氨苄青霉素,47,既含有抗四环素基因也含有抗氨苄青霉素基因,只含有抗四环素基因,只含有抗氨苄青霉素基因,既不含有抗四环素基因也不含有抗氨苄青霉素基因,48,重组DNA分子的模拟操作,注意：这两条DNA分子的碱基对不是随意乱写的。 首先，每个DNA分子上的两条链上的碱基要互补配对； 第二，每个DNA分子中每条链都存在一个G-A-A-T-T-C的碱基序列，也

14、就是说是EcoRI限制酶的识别位点，并存在G-A的切割位点。,49,天然的DNA分子可以直接用做基因工程 载体吗？为什么？,提示：基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是 质粒（plasmid），即独立于细菌拟核处染色 体DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的 裸露的DNA分子。 是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？ 不是 作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：,50,1） 载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。 2） 载体DN

15、A必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。 3） 载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。 4） 载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。 5） 载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。 实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。,51,DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？,迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA的酶。,52,思考：

16、一、质粒是基因工程中最常用的运载体，它的主要特点是（ ） 1能自我复制 2、不能自我复制 3、结构很小 4、成分是蛋白质 5、是环状DNA分子 6、是环状RNA分子 7、链状DNA分子 8、能友好地借居在宿主细胞中 二、质粒上会存在某些标记基因，这些标记基因有什么用途？,1、3、5、8,便于筛选、识别,三、要想将某个特定基因与质粒相连，需要用几种限制性内切酶和几种DNA连接酶处理？ 为什么？,一种,53,例1、以下是两种限制酶切割后形成的DNA片段， 试分析： GC AATTC GC CTTAA CG G CG G (1)其中和 是由一种限制酶切割形成的 末端，两者要重组成一个DNA 分子，所

17、用DNA连接酶通常是 。 (2) 和 是由另一种限制酶切割形成的 末端，两者要形成重组DNA片段，所用的连接酶通常是 。,平,T4 DNA连接酶,黏性,Ecoli DNA连接酶,54,例2、某科学家从细菌中分离出耐高温淀粉酶（Amy） 基因a,通过基因工程的方法，将a转到马铃薯植株中，经检测发现Amy在成熟块茎细胞中存在。这一过程涉及 A.目的基因进入受体细胞后，可随着马铃薯的DNA分子的复制而复制，传给子代细胞 B.基因a导入成功后，将抑制细胞原有的新陈代谢，开辟新的代谢途径 C.细菌的DNA分子较小，可直接作为目的基因，导入受体中不需要整合到马铃薯的DNA分子中 D.目的基因来自细菌，可以

18、不需要运载体直接导入受体细胞,A,例：限制性内切酶的识别序列和切点是GGATCC，限制性内切酶的识别序列和切点是GATC。在质粒上有酶的一个切点，在目的基因的两侧各有一个酶的切点。 （1）请画出质粒被限制酶切割后所形成的黏性末端。 （2）请画出目的基因两侧被限制酶切割后所形成的黏性末端。 （3）在DNA连接酶作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接？为什么？,可以连接。因为由上述两种不同限制酶切割后形成相同的黏性末端（或是可以互补的）,小试身手,随堂练习：,1、关于限制酶的说法中，正确的是（ ） A、限制酶是一种酶，只识别GAATTC碱基序 列 B、EcoRI切割的是GA之间的氢

19、键 C限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切 割外源DNA D限制酶只存在于原核生物中,答案：C,57,2、以下说法正确的是 （ ） A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶 切点，以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来,C,58,3、下列不是基因载体具备的条件的是（ ） A、能自我复制 B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 D、它是环状DNA,D,59,4、有关基因工程的叙述中，错误的是（ ） A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、限制性核酸内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因

20、须由载体导入受体细胞 D、人工合成目的基因不用限制性内切酶,A,60,5、有关基因工程的叙述正确的是 （ ） A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,D,61,6、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因工程操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 （ ） A、人工合成目的基因 B、目的基因与载体结合 C、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达,C,A,7、在将胰岛素的基因与质粒形成重组DNA分子的过程中，下列哪组是所需要的 同一种限制酶切割两者； 不需同一种限制酶切割两者； 加入

21、适量的DNA连接酶； 不需加DNA连接酶 A B C D,8、（多选）有关基因工程的叙述中，错误的是 A、基因工程技术能定向地改造生物的遗传 性状，培育生物新品种 B、重组DNA的形成在细胞内完成 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、质粒都可作为运载体,答案：BD,9、下列四条DNA分子，彼此间具有粘性末端的一组是 A B C D,答案：D,10、下列黏性末端属于同种内切酶切割而成的 是（ ） A、 B、 C、 D、,T C G A G C T T A A,A G G T T C C A,A G C T T C A G,A A T T C G,11、下列哪一种酶是基因工程的工具酶 A、DN

22、A连接酶 B、DNA酶 C、RNA酶 D、运载体,13、下列说法正确的是：（ ） A、限制酶的切口一定是GAATTC碱基序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、重组技术所用的工具酶是限制酶、 连接酶、运载体 D、利用运载体在宿主细胞内对目的基因 进行大量复制的过程可称为“克隆”,14、在基因工程中，切割运载体和含有目的基因 的DNA片段，需使用（ ） 同种限制酶 B. 两种限制酶 同种连接酶 D. 两种连接酶 15、基因工程常用的受体细胞有（ ） (1)大肠杆菌 （2）枯草杆菌 （3）支原体 （4）动植物细胞 A. （3）（4） B. （1）（2）（4） C. （2）（3）（4） D. （

23、1）（2）（3）,16、 如图为大肠杆菌及质粒载体的结构模式图，据图回答下列问题。,(3)氨苄青霉素抗性基因在质粒DNA上称为_，其作用是 _。 (4)下列常在基因工程中用作载体的是() A苏云金芽孢杆菌抗虫基因 B土壤农杆菌中的RNA分子 C大肠杆菌的质粒 D动物细胞的染色体,【思路点拨】本题通过质粒结构的模式图考查质粒的功能和特点，分析如下：,17、(2011年北大附中高二检测)下列关于DNA连接酶的叙述正确的是() 催化相同黏性末端的DNA片段之间的连接 催化不同黏性末端的DNA片段之间的连接 催化两个黏性末端互补碱基间氢键的形成 催化DNA分子两条链的脱氧核糖与磷酸之间磷酸二酯键的形成 AB C D 【尝试解答】D,18 、(2011年雅礼中学高二检测)基因工程中，须使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制酶的识别序列和切点是GGATCC，限制酶的识别序列和切点是GATC。根据图示判断下列操作正确的是(),A目的基因和质粒均用限制酶切割 B目的基因和质粒均用限制酶切割 C质粒用限制酶切割，目的基因用限制酶切