武汉大学-色谱分析法原理.ppt

1、第11章色谱原理，11.1概述色谱早在1903年被采用，当时俄罗斯植物学家分离植物色素。后来，它不仅用于分离有色物质，还用于分离无色物质，各种色谱出现了。然而，不管它属于哪种色谱，它的共同基本特征是它有两个相：固定相，即所谓的固定相；另一个相是携带样品通过固定相的移动体，称为移动相。当流动相中的样品混合物通过固定相时，它将与固定相相互作用。由于每种组分的性质和结构不同，与固定相相互作用的类型和强度也不同。因此，在相同驱动力的作用下，不同组分在固定相中的停留时间不同，从而以不同的顺序流出固定相。俄罗斯植物学家迈克尔茨维特(1872-1919)发现了柱色谱的基本原理。他通过在碳酸钙柱上洗脱色素混合

2、物来分离植物色素。各种颜料被分成不同的颜色带；因此得名色谱。为了分离植物色素，他将植物绿叶的石油醚提取物倒入装有碳酸钙粉末的玻璃管中，并用石油醚自上而下冲洗。由于不同的颜料在碳酸钙颗粒表面有不同的吸附力，不同的颜料随着洗涤以不同的速度下移，形成不同颜色的条带，从而分离出不同的颜料组分。他将这种分离方法命名为色谱法。在色谱发展史上占有重要地位的英国学者马丁和辛格提出了色谱塔板理论；发明了液-液分配色谱法；据预测，气体可以用作流动相(即气相色谱)。1952年，他们因对分配色谱理论的贡献获得了诺贝尔化学奖。色谱的优点和缺点：分离效率高；分析速度快；检测灵敏度高；样品消耗量低；良好的选择性；多组分同时

3、分析；易于自动化。质量能力差。A.J. P. MARTIN和R.L.M. Synge，A.J. P. MARTIN。(1910-2002)英国国家医学研究所与他的同胞R. L. M .辛格分享了诺贝尔化学奖(1952)，因为他发明了分配色谱。辛吉出生于1914年10月28日，英国利物浦，1994年8月18日逝世于诺福克郡诺里奇。辛格在剑桥的温彻斯特学院学习，并于1941年在三一学院获得博士学位。2。色谱的发展历史，3。诺贝尔奖的研究工作中，色谱发挥了关键作用，显微分离过程，色谱分类，1。根据两相状态，带流动相的气相色谱称为气相色谱，气固色谱和气液色谱可以根据固定相是固体吸附剂还是固定液(附着在

4、惰性载体上的有机化合物液体薄层)来区分。同样，液相色谱可以分为液-固色谱(LSC)和液-液色谱(有限责任公司)。以超临界流体为流动相的色谱称为超临界流体色谱。随着色谱的发展，固定液通过化学反应与载体表面结合。这种化学键合固定相色谱也称为化学键合相色谱(CBPC)。根据分离机理的分类，利用组分在吸附剂(固定相)上不同的吸附能力来分离组分的方法称为吸附色谱法。在固定液(固定相)中分离不同溶解度组分的方法称为分配色谱法。离子交换色谱是一种通过离子交换剂(固定相)上的不同亲和力来分离组分的方法。凝胶色谱或尺寸排阻色谱用于在多孔固定相中通过选择性渗透分离不同尺寸的分子。最近，出现了一种新的分离技术，它利

5、用不同组分和固定相(固定分子)的高亲和力进行分离，这种技术被称为亲和层析，常用于蛋白质的分离。根据固定相的形状将固定相填充到柱中的色谱是ca带有平板固定相的色谱称为平板色谱，平板色谱可分为薄层色谱和纸色谱。根据上述，色谱的分类总结在表18-1中.11.2色谱流出曲线及相关术语-流出曲线和色谱峰，如果进样量很小且浓度很低，如果色谱峰在吸附等温线的线性范围内是对称的，则可以用高斯正态分布函数表示，其中：不同时间点的物质浓度，C0进样浓度，保留时间和标准偏差。2，基线是当只有色谱柱中的流动相通过时，检测器响应信号的记录值，即图183中Ot线的稳定基线应为水平直线。3，峰高，色谱峰和基线之间的垂直距离

6、，表示为H，如图183所示，BA，4，保留值，1，死时间tM，当未被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到峰最大值。因为这种物质不被固定相吸附或溶解，它的流速将接近流动相的流速。当测量流动相的平均线速度时，可以通过L与tM的比值来计算。从样品注射开始到柱后最大峰值点的经过时间称为保留时间，如图183 OB所示，它对应于样品到达柱末端检测器所需的时间，2保留时间tR，3调整后的保留时间tR扣除停滞时间后的组分保留时间称为组分的调整后保留时间，即tR=tR-tM。TR实际上是组分在固定相中的总保留时间，可以用时间单位(如秒)或距离单位(如厘米)表示。保留时间是色谱定性分析的基本依据，但同一组

7、分的保留时间往往受流动相流速的影响，因此色谱工作者有时会使用保留体积等参数进行定性验证。4死体积VM是指色谱柱管中固定相颗粒之间的剩余空间、色谱中管道和连接器之间的空间以及色谱柱填充后检测器的空间的总和，当后两项太小而不能忽略时，死体积可由死时间和流动相的流速F0(Lmin)计算得出：VM=tMF0，5。保留体积VR是指从注射开始到柱后被测组分的最大浓度点之间流动相的体积。保留体积和保留时间t。关系如下：VR=tRF0，6调整后的保留体积VR扣除死体积后，称为该组分的调整后保留体积，即VR=VR- VM，7相对保留值2.1组分2的调整后保留值与组分1的调整后保留值之比称为相对保留值： 因为相对

8、保留值仅与柱温和固定相性质有关，与柱直径、柱长、填充条件和流动相流速无关。 因此，它被广泛应用于色谱定性数据，尤其是气相色谱。必须注意的是，相对保留值绝对不是两种组分的保留时间或保留体积之比。在定性分析中，选择因子通常将一个色谱峰固定为标准，然后计算其他峰相对于该峰的保留值。此时，ri/s，它也可能小于1。在多变量混合物分析中，通常选择最难分离的一对物质，它们的相对保留值作为重要参数。在这种特殊情况下，它可以用符号表示：其中tR2是后一个峰的调整保留时间，因此此时它总是大于1。色谱峰的面积宽度是色谱柱中组分光谱带扩展的函数，它反映了色谱操作条件的动态因素。通常有三种方法测量色谱峰的面积宽度：1

9、 .如图183所示，在0607倍峰高时，标准偏差为色谱峰宽度的一半。2.半峰宽W1/2是对应于半峰高的峰宽，如图183所示。生长激素和标准偏差之间的距离关系为：关系为：W=4、3。基线宽度w，来自色谱流出曲线，信息是：(1)根据色谱峰的数量，可以判断样品中组分的最小数量；(2)根据色谱峰的保留值(或位置)，可以进行定性分析；(3)根据色谱峰下的面积或峰高，可以进行定量分析；(4)它是评价色谱柱分离效率的依据。(5)色谱峰的两个峰之间的距离是评价固定相(和流动相)是否合适的基础。动画演示，11.3色谱分析的基本原理色谱分析的目的是将样品中的成分相互分离。为了实现组分的完全分离，两个峰之间的距离必

10、须足够远。两个峰之间的距离由两相之间组分的分布系数决定，它与色谱过程的热力学性质有关。然而，尽管两个峰之间有一定的距离，如果每个峰都很宽，彼此重叠，就不能分开。这些峰的宽度或窄度由色谱柱中组分的传质和扩散行为决定，这与色谱过程的动力学性质有关。因此，应该从热力学和动力学的角度研究色谱行为。1.如上所述，分配色谱的分离是基于样品组分在固定相和流动相之间的重复分配过程，而吸附色谱的分离是基于重复的吸附-解吸过程。这种分离过程通常由样品分子在两相之间的分配来描述，描述这种分配的参数称为分配系数，它是指在一定温度和压力下分布在固定相和流动相之间的组分的浓度比，即分配比k，它也称为容量因子，它是指在一定

11、温度和压力下分布在固定相和流动相之间的组分的质量比。也就是说，k值越大，固定相中的组分越多，这相当于色谱柱的容量越大，因此也称为分配容量或容量因子。它是衡量色谱柱对分离组分保留能力的一个重要参数。k值还取决于组分和固定相的热力学性质。它不仅随柱温和压力的变化而变化，还随流动相和固定相的体积而变化。其中CS和Cm分别是固定相和流动相中组分的浓度；Vm是色谱柱中流动相的体积，大约等于死体积。Vs是色谱柱中固定相的体积，在不同类型的色谱中有不同的含义。例如，在分配色谱中，Vs代表固定液体的体积；在尺寸排阻色谱中，固定相的孔体积表示。保留因子Rs和分配比k可直接从色谱图中测量。假设柱中流动相的线速度为

12、，柱中组分的内部速度为。由于固定相对组分有保留作用，所以两种速度之比称为保留因子Rs。Rs如果用质量分数表示，即组分和流动相通过长度为l的色谱柱所需的时间分别为、分布系数k和分布比k之间的关系可以得到，它被称为比值，比值是反映各种色谱柱特性的另一个参数。例如，对于填充柱，其值通常为635；对于毛细管柱，该值为60600。根据上述公式，甲、乙组分的选择因子可由下式表示。上述公式表明，通过选择因子将实验测量值K与热力学性质的分布系数K直接联系起来具有实际意义。如果两个组分的k或k值相等，则=1，两个组分的色谱峰将重合，表明它们不能分离。两个分量之间的k或k值的差越大，分离越好。因此，我(二)以气相

13、色谱为例，载气不是连续进入色谱柱，而是以脉动方式进入，每次一个塔盘体积(Vm)。(iii)所有组件在开始时都存在于0号塔盘上，样品沿轴向(纵向)的扩散可以忽略不计。(四)所有塔板的分配系数都是恒定的，与某一塔板的组分数量无关。为简单起见，让色谱柱由五个塔板组成(n5，n是色谱柱的塔板数)，塔板数用R表示，r=1，2，nl；某一组分的分配比为k=1。根据上述假设，该组分的分布可计算如下：在开始时，如果在分配平衡后将单位质量，即m=1(例如，1毫克或1克)，添加到0号塔板，因为k=1，即ns=nm，nm=ns=0.5。当具有板体积(lV)的载气以脉动方式进入0号板时，在气相中含有纳米组分的载气被推

14、到1号板上。此时，0号板液相(或固相)中的ns组分和1号板气相中的nm组分将在两相之间重新分布。因此，0号板中包含的组分总量为0.5，其中气-液(或气-固)相分别为0.25，而1号板中包含的总量也为0.5。此后，每当新的板体积载气以脉动方式进入色谱柱时，上述过程将重复一次(见下表)。根据上述分布过程，对于n=5、k=1和m=1的系统，随着进入塔内板体积的载气脉动的增加，塔内任意板上分布的组分总量(气液两相中的总质量)可由塔板理论建立，流出曲线方程可建立如下：m为组分质量，Vr为保留体积，n为理论塔板数。当流动相体积V=Vr时，C值最大，即柱长：L，塔板间的虚拟距离：H，柱的理论塔板数：N，则理

15、论塔板数与色谱参数的关系为：从以上两个公式可以看出，色谱峰越小，氮越大，而氢越小，柱效率越高。因此，n和h是描述色谱柱性能的指标。通常，n103，H1mm的列被填充。而毛细管柱n=105-106，H0.5mm，因为死亡时tM包含在tR中，而实际的tM不参与柱中的分布，所以计算的n值尽可能大，h非常小，但它与实际的柱效率相差甚远。因此，建议扣除tM，并使用有效理论塔板数neff和有效塔板高度Heff来评价柱效率。塔板理论从热力学角度形象地描述了色谱柱中溶质的分布平衡和分离过程，导出了流出曲线的数学模型，成功地解释了流出曲线的形状和最大浓度的位置，提出了计算和评价柱效的参数。然而，它的一些基本假设与塔中