DNA的琼脂糖凝胶电..ppt

1、DNA的琼脂糖凝胶电泳,组员：黎振威 成波 程星星 刘世杰,琼脂糖,琼脂糖是线性的多聚物，基本结构是1,3连结的-D-半乳呋喃糖和1,4连结的3,6-脱水-L-半乳呋喃糖。琼脂果胶是由许多更小的分子组成的异质混合物。琼脂糖在水中一般加热到90以上溶解，温度下降到35-40时形成良好的半固体状的凝胶，这是它具有多种用途的主要特征和基础。琼脂糖凝胶性能通常用凝胶强度表示。强度越高，凝胶性能越好。,琼脂糖与琼脂的区别,琼脂是由琼脂糖和琼脂果胶组成的。琼脂糖的结构单元是 D-半乳糖和3.6-脱水-L-半乳糖；琼脂果胶是由许多更小的分子组成的异质混合物。它们的结构相似，但琼脂果胶带硫酸根和羧基组分，凝胶

2、能力差。在琼脂糖制备过程中需要把琼脂果胶尽量去除，否则琼脂糖有可能存在极微量硫酸根和丙酮酸取代电离基团，就会造成电内渗，电内渗对质点的移动产生影响。质量较好的琼脂糖硫酸根含量比较低，通常在0.2%以下。琼脂糖是从琼脂中精细提取的，有自身独特的性质，所以琼脂糖要比琼脂贵得多。,实验目的,掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的原理和方法。,琼脂糖凝胶电泳技术,特点： （1）操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可以进行电泳。 （2）琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占98%99%），近似自由电泳，样品扩散较自由，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。 （3）琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外

3、光灯检测及定量测定。 （4）电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。,实验原理,DNA分子在琼脂糖中泳动时有电荷效应和分子筛效应，但主要为分子筛效应。在pH=8.08.3时，核酸分子中的碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，分子大小和构象不同的核酸分子的迁移率呈现较大的差异，从而达到分离核酸片段，检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。,影响DNA分子迁移速率的因素,1.DNA分子大小 2.DNA分子构象 3.琼脂糖的浓度 4.电压强度大小

4、5.离子强度大小 6.嵌入染料的存在(溴化乙锭),实验器材与试剂,器材：板式平板电泳槽、电泳仪、微波炉、紫外透射仪。 试剂（1）6X上样缓冲液：含0.25%溴酚蓝、 0.25%二甲苯青、30%甘油的TBE缓冲液。 （2）5XTBE电泳缓冲液（0.45mol/L Tris-硼酸、0.01mol/L EDTA，pH=8.3)：称取54g Tris碱、27.5g硼酸、 3.7g EDTA-Na22H20，溶于800mL蒸馏水中，定容至1000mL. 使用时用蒸馏水稀释10倍成为0.5XTBE电泳缓冲液。 （3）琼脂糖。 （4）溴化乙锭（EB）10mg/ml:取EB0.10g，完全溶解于10ml水中，

5、避光室温保存。 （5）DNA分子量标准品 （6）DNA样品液。,实验操作,（1）制备琼脂糖凝胶 称取0.6g琼脂糖粉，放入锥形瓶中，加入60ml0.5XTBE电泳缓冲液，置于微波炉或水浴中加热熔化，取出摇匀即为1%琼脂糖凝胶液。待凝胶液冷却至60度后加入溴化锭3ul，使其终浓度为0.5ug/ml。 （2）胶板的制备 在制胶槽内插入样品梳，将凝胶液倒入制胶槽中。待胶凝固后，取出梳子，将内槽放入电泳槽中，加入TBE缓冲液至槽中，使其没过凝胶表面12mm，排出加样孔中的气泡。 （3）加样 用移液器将DNA样品液5ul与5X上样缓冲液1ul混匀后加入加样孔，记录点样顺序。其中一个加样孔中加入DNA分子

6、量标准品6ul。 注意：加样时需将枪头伸入加样内再排出样品，以免样品从凝胶表面扩散；加样时，枪头不要穿刺孔底或碰坏凝胶孔壁，否则将导致样品从凝胶底部渗出或DNA带型不整齐。,（4）电泳 接通电泳槽与电泳仪之间的电源（切忌DNA样品由负极往正极泳动）。调节电压U=5V/cmX正、负极间的距离（cm），开始电泳。 （5）实验结果的观察 在紫外透射仪上观察电泳带及其位置，用300nm(波长太长灵敏度不够，太短对DNA损伤严重)左右波长的紫外线照射，DNA存在处应显出橘红色荧光条带。照相记录实验结果。,注意事项,（1）倒胶时把握好胶的温度，不要高于60C，否则温度太高会使制胶板变形。 （2）胶一定要凝

7、固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄坏点样孔。 （3）点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，不要刺穿凝胶。 （4）溴化乙锭见光易分解，应置于棕色瓶内于4C下保存。溴化乙锭在紫外灯下放置时间过长，荧光会猝灭。 （5）溴化乙锭是强致突变剂，操作中切勿用手接触，应戴一次性手套操作，避免污染实验台面。,思考题,（1）琼脂糖与琼脂有什么不同？本次实验为何选琼脂糖作电泳介质？ 答：琼脂糖是用来做核酸电泳的，琼脂是用于组织培养做固化剂的，两者都有固化作用，不过琼脂是一个简单的固化支撑作用，而琼脂糖在特定缓冲体系中形成孔状结构用于大分子的分离。所以选琼脂糖作为电泳介质。 （2）上样缓冲液由哪些成分组成？各有何作用？ 答：溴酚蓝，二甲苯青和TBE。 溴酚蓝是一种pH指示剂，在pH3.04.6内由黄变蓝。二甲苯青用于琼脂糖聚凝胶电泳的示踪染料, 易溶于水和醇 ,在琼脂糖凝胶电泳中可与溴酚蓝按照一定比例配置. TBE的缓冲容量小，但是溶解性能好，可以配成高浓度储备液，使用方便。 （3）常用的DNA琼脂糖凝胶电泳缓冲液有哪些？为何在这些电泳缓冲液中要加入EDTA？ 答：核酸电泳缓冲液有三种，即Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)和Tris-磷酸(TPE).TBE 与 TPE缓冲容量高，DNA分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容