食品安全地方标准生鲜乳中舒巴坦敏感β内酰胺酶类药物检验方法杯碟法征求意见稿

1、直播卫星江苏省地方标准dbs 32/xxxxxxx食品安全地方标准的食品微生物检验原料乳中舒巴坦敏感的-内酰胺酶测试方法-杯碟法征求意见稿xxxx-xx-xx版本xxxx-xx-xx实施江苏省卫生厅发布前言本标准首次发布。食品安全地方标准的食品微生物检验生牛奶中舒巴坦敏感-内酰胺酶的测定方法杯碟法1范围本标准规定了原料乳中舒巴坦敏感-内酰胺酶药物的检验方法。本标准适用于原料乳中舒巴坦敏感-内酰胺酶的检测。本标准适用于新鲜乳制品(液体或溶解乳制品)中舒巴坦敏感-内酰胺酶的检测。该方法的检出限为4u/ml。2 .规范性参考文件下列文件对本文件的应用至关重要。对于所有注明日期的参考文件，只有注明日期

2、的版本适用于本文件。对于未注明日期的参考文件，最新版本(包括所有修订订单)适用于本文件。卫生部200944号关于印发牛奶和乳制品中舒巴坦敏感-内酰胺酶检验方法杯碟法的通知3设备和材料除微生物实验室的常规灭菌和培养设备外，其他设备和材料如下：3.1抑菌圈测量仪或测量尺。3.2恒温培养箱：361。3.3高压釜。3.4内径为90毫米的：无菌培养皿，平坦光滑的玻璃皿，带有瓷砖盖。3.5无菌牛津杯：外径(8.00.1)毫米，内径(6.00.1)毫米，高度(10.00.1)毫米3.6酸碱度计。3.7无菌吸管：1毫升(0.01毫升刻度值)，10毫升(0.1毫升刻度值)。3.8进样器：5 l 20 l，20

3、l 200 l，支持吸头。3.9离心管：1.5毫升3.10无菌镊子。4培养基和试剂除非另有规定，所有使用的试剂均为分析纯，水为国标6682规定的三级水。4.1试验菌株：藤黄微球菌cmcc(b) 28001，不超过14代。4.2磷酸盐缓冲溶液：根据附录a中的a.1。4.3青霉素标准溶液：根据附录a中的附录a.24.4-内酰胺酶标准溶液：如附录a的附录a.3所述4.5舒巴坦标准溶液应符合附录a.4的规定.4.6营养琼脂培养基：根据附录a中的a.5。4.7抗生素检测用培养基ii:根据附录a中的a.6。5个操作步骤5.1细菌悬液的制备将藤黄微球菌接种在两块营养琼脂平板上，在361培养18 24小时，将

4、两块营养琼脂平板上的所有菌落刮入磷酸盐缓冲液中制成新鲜菌悬液，其最终浓度应大于11010 cfu/毫升，应在制备当天使用。5.2样品的制备将待测样品混合均匀，取1毫升待测样品，放入1.5毫升离心管中，离心管上分别标有甲、乙、丙、丁，每个样品做三个平行管，共12管。同时，以磷酸盐缓冲液为对照，进行空白试验。5.3检验板的准备5.3.1取一个90毫米无菌玻璃培养皿，在底部加入10毫升无菌抗生素检测培养基，并等待其凝固。5.3.2取适量培养基进行抗生素检测，加热溶解，然后冷却至40 45，加入4%藤黄微球菌悬液。5.3.3将5ml含藤黄微球菌悬液的抗生素检测培养基盖在底部培养基上，放置备用。5.4牛

5、津杯的位置如图1所示，在盘子上标记四个点a、b、c和d，并将牛津杯放在相应的位置。图15.5样品的测定将-内酰胺酶标准溶液、舒巴坦标准溶液和青霉素标准溶液加入：青霉素5 l。舒巴坦钠25 l，青霉素5l。c -内酰胺酶25 ll，青霉素5 l。25微升-内酰胺酶、25微升舒巴坦和5微升青霉素。混合均匀后，将上述a d样品各200 l加入置于试验板上的四个无菌牛津杯中，在361培养18 24 h，并测量抑菌圈直径。对于每个样本，取三个平行测试的平均值。6结果报告磷酸盐缓冲液的结果应该是：(a)、(b)和(d)都产生抑菌圈；与(b)抑菌圈相比，(a)和(b)相差在3 mm以内(含3 mm)，重复性

6、好；(c)的抑菌圈小于(d)的抑菌圈，差异在3 mm以上(含3mm)，重复性好。如果这是结果，则系统被建立，并且样本结果可以如下判断。6.1如果样品结果中的(乙)和(丁)均产生抑菌圈，且(丙)和(丁)抑菌圈之间的差异大于3毫米(含)，则可根据6.1.1和6.1.2判断结果。6 . 1 . 1(a)和(b)的抑制区之差大于3毫米(含3毫米)，重复性好。应判断样品中添加了-内酰胺酶，-内酰胺酶药物的检测结果应报告为阳性。6 . 1 . 2(a)和(b)的抑菌圈之差小于3毫米，重复性好。应判断样品中未添加-内酰胺酶，-内酰胺酶类药物检测结果为阴性。6.2如果(a)和(b)不产生抑菌圈，应在测试前稀释

7、样品。aa附加记录a(规范性附录)培养基a.1磷酸盐缓冲溶液(ph 7.4)无水磷酸二氢钾14.0克无水磷酸氢二钾5.2g1000毫升蒸馏水在121高压灭菌15分钟。a.2青霉素标准溶液准确称取适量青霉素标准物质，用磷酸盐缓冲溶液溶解，使其成为恒定体积为0.1毫克/毫升的标准溶液。当天准备，当天使用。a . 3-内酰胺酶标准溶液准确测量或称取适量-内酰胺酶标准物质，用磷酸盐缓冲溶液溶解，制成适当浓度的标准溶液。当天准备，当天使用。a.4舒巴坦标准溶液准确称取适量舒巴坦标准品，用磷酸盐缓冲溶液溶解，分装后保持在-20，不要反复冻融。a.5营养琼脂蛋白胨10g牛肉膏3g氯化钠5g琼脂15-20克1000毫升蒸馏水将上述组分加入蒸馏水中，混合均匀，在121高压灭菌15分钟。冷却至45-60，倒入平板中。(注：如不立