流式细胞术的样品制备.ppt

1、流式细胞术样品制备、FCM样品制备包括单分散细胞悬液制备技术、细胞生物学特征标记技术和荧光染色技术，FCM是一种能够定量测定细胞和细胞器结构和某些功能，并根据细胞亚群特征性质进行分类的技术。 FCM实验对象为单细胞或单细胞核悬液，制备FCM技术合格的单细胞悬液是非常重要的环节，这些单细胞悬液主要来源于单层细胞、血液、脱落细胞、实体组织及残奥翅包埋组织等。 一、单层培养细胞分散在单一细胞壁中的单层培养细胞单细胞悬液的制备操作步骤： 1、丢弃单层培养细胞(对数生长期)中的老培养液。 2 .加入少量的0.25%胰蛋白酶，消化细胞，倒置显微镜下观察，细胞稍圆时立即停止消化(如果是含有10%牛胎儿血清的

2、培养基)，收集细胞，离心去除上清，用PBS液清洗细胞，离心去除上清，留下约0.5ml (二)悬浮培养细胞单细胞悬浮液的制备操作步骤： 1、离心除去老培养液，用PBS液洗涤一次细胞，离心除去上清液，留下约0.5ml的细胞悬浮液，用振荡器分散细胞。 2 .如果没有及时的曳引机检查，必须固定细胞，通常的固定液为70%乙醇，然后保存于4冰箱。 二、制备实体组织单分散细胞新鲜实体组织的新鲜实体组织是手术或活检后根据检查目的采集的样品，该样品应及时进行适当的保存处理，如固定剂或低温保存组织，以免室温过高，放置时间过长组织自溶，影响检查结果新鲜实体组织单细胞悬液的制备方法如下：酶消化法机械法剪切破碎法网揉搓

3、法化学试剂处理法、酶消化法酶在实体组织中的分散作用原理主要有3个方面：一个可以破坏组织间的胶原。 二是能水解组织细胞粘附装置的蛋白性物质。 三是可水解组织间粘多糖物质。 酶消化法是实体组织分散在单细胞中的主要方法，常用酶类试剂有：蛋白质组学类(如胃蛋白酶、木瓜蛋白质组学、链酶和中性蛋白质组学等)可以释放所有组织中的细胞。 胰酶是能水解脂键和肽键的几种分子型胶原蛋白分解胶原酶糖蛋白和肽的糖苷键的溶菌酶； 弹性蛋白酶能消化组织的糖蛋白和弹性蛋白连接的纤维，能够利用于解离血管、心脏、肝脏的细胞。 为了分散组织细胞，必须应用酶学方法注意条件的选择和影响因素：酶必须溶解在适当的溶液中，该溶液注意酶效价的

4、降低组织消化液中消化时间注意酶活性的PH值注意酶的应用浓度对随时影响注意酶活性的其他因素的分散程度有一定的限制， 特别是在进行免疫标记实验时，酶处理可能会改变细胞膜的成分而产生影响，值得关注的是，用于组织分散的多种酶不仅不纯，主导性酶，在不同程度上还混有其他污染物，它们的活性有利于组织分散，可能对组织的结构和功能产生不良影响。 酶学方法的一般步骤：将适合酶消化的组织放入离心管。 将选择的酶溶液1-2ml放入已消化组织的试管中。 一般消化20-30分钟(恒温37C或室温)，消化中间接地振动或吹走。 停止消化，取细胞悬浊液，用尼龙网(200目)过滤，除去大块，低速离心除去细胞碎片。 对制备的单细胞

5、进行流式细胞术分析或保存。用机械法分裂实体组织：用剪刀切断或用锐利的解剖刀切断，用匀浆机匀浆，用细注射针吸引细胞分散细胞。 网络拾取法也同样可以得到大量的细胞。 机械法容易引起细胞悬浮液中细胞的碎片，所以机械法常与其他方法并用。 常用的几种机械法的制造过程是：剪切法：将组织块放入平盘，加少量盐水。 用剪刀把组织切成匀浆状。 加入生理盐水10ml。 用吸管吸取组织的匀浆，首先用100目的尼龙网过滤到试管中。 离心沉淀1000prm3-5分钟，再用生理盐水洗涤3次，每次用短时间低速离心沉淀(500-800prm )除去细胞碎片。 用300目的尼龙网过滤除去细胞块。 固定70%冰乙醇，放入4个冰箱。

6、 网揉法：将100目铜网刺入烧杯。 将切断的组织放置在网上，用眼科镊子轻轻擦拭组织块，同时用生理盐水冲洗，直至擦拭完组织。 用300目的尼龙网过滤细胞悬浮液，去除大块细胞悬浮液，收集细胞悬浮液，1000prm，离心沉淀5分钟。 70%的乙醇固定，放置4个冰箱备用。 研磨法准备70ml的组织研磨器，将组织切成小块。 放入组织研磨器中，加入生理盐水1-2ml。 转动研棒，磨到匀浆为止就可以了。 加入生理盐水10-20ml，洗净磨削器。 取细胞悬浮液，用300目尼龙网过滤，500-800prm，离心沉淀12分钟，用生理盐水洗涤3次，离心沉淀。 化学试剂处理法化学试剂处理法的主要原理是在细胞间置换起到

7、粘连作用的钙镁离子，使细胞分散。 试剂调制： 0.2调制溶解EDTA0.2g后，加入Hanks液100ml，封入高压消毒，保存0-4。 胰酶加EDTA制备了胰酶0.25g PBS(PH7.0)200ml、浓度0.125%、EDTA0.2g PBS(PH7.0)200ml、浓度0.2%。 分别各混合40ml，放入不同装置的冰箱保存，用时间过滤即可。 实验步骤：将组织切成薄片放入试管。 加入5 ml EDTA液，在室温下放弃30分钟。 加入胰酶EDTA液5-10ml，37恒温水浴30分钟，间歇振荡35次。 用300目尼龙网过滤，1000prm，离心沉淀5分钟，再用生理盐水洗涤23次，500-800

8、prm，离心12分钟。 70%的乙醇固定在冰箱上检查。 实验证明，用化学试剂处理组织会降低细胞的成活率，降低细胞产量，细胞碎片和细胞丛量不稳定，因此化学试剂处理方法不能单独使用，可与其他方法联用。 机械法常常引起严重的细胞损伤、低细胞产量，为了使细胞碎片不影响FCM检查结果，必须用合适的方法去除碎片或尽量减少碎片。 酶学方法对实体肿瘤的分散解聚是理想的，但由于不影响所测化学成分，因此可根据使用目的选择合适的单细胞悬浮液制备方法，得到理想的样品和更好的FCM结果。 注意事项：新鲜组织标本应及时保存，避免组织在室温下放置时间过长，细胞自溶，DNA分解，影响FCM测定结果。 根据实验目的选择最合适的

9、细胞固定方法，用固定剂防止FCM检查结果变得不稳定。 酶学法注意条件的选择和影响因素，注意酶在溶剂、消化时间、pH值、浓度等方面对酶消化法的影响。 富含细胞的肿瘤(淋巴瘤、视神经母细胞瘤、脑肿瘤、未分化癌、髓样癌及一些软组织肉瘤)不是通过酶学或化学方法，而是通过单独的机械方法接收大量的单分散细胞。 使用酶学方法时，应重视酶的选择。 例如，含有食道癌、乳腺癌、皮肤癌等结缔组织较多的肿瘤，优选使用胶原酶。 原因是胶原酶存在Ca2、Mg 2，或具有血清状态下活性不降低的特征。 实验方法：残奥翅包埋组织在切片机上切取40-50m厚组织片35片。 将切下的组织片放入试管。加入二甲苯5-8ml脱蜡(室温下

10、)，12天内，根据残奥翅片蜡有无脱蜡，更换一次二甲苯，脱蜡后，可以丢弃二甲苯。 水合：依次加入100%、95%、70%、50%梯度的酒精5ml，每步骤10分钟，去乙醇，加入蒸馏水3-5ml，10分钟后丢弃。 消化：加入0.5%胃蛋白酶2ml(ph1.52.0 )，在37恒温水浴中消化30分钟，消化期间每隔10分钟振动一次。 制备残奥翅片包埋组织单细胞悬液，消化30分钟后，立即加入生理盐水中止消化。 经300目尼龙网过滤，未消化的组织片可二次消化。 取细胞悬液，离心沉淀1500prm，生理盐水12次，离心沉淀1500prm，再生理盐水12次，离心沉淀500-800prm，碎片除去。 以制备的单细

11、胞悬液为涂膜，AO染色经荧光显微镜观察，为完整的细胞核，应发出黄绿色荧光。 加入单细胞样品1106细胞/ml、荧光染色液溴化乙锭(EB )或碘化铑(PI)1ml，放入04冰箱中30分钟，用300目尼龙筛过滤后，用上机检查。 注意事项：必须从组织中脱除残奥散热片蜡，检查是否脱除残奥散热片蜡的方法是，丢弃二甲苯，放入100%乙醇，絮凝物不浮起，则视为脱除了残奥散热片蜡，反而没有脱除。 消化时间不能过长。 不要让放出的细胞核消化。 切片不能太薄或太厚。 太薄的话碎片会增多，影响流式分析结果，太厚的话会导致脱蜡变得不纯，或者脱蜡时间过长，因此优选40-50m。 二、血液单细胞样品制备血液为天然单细胞分

12、散细胞悬液，血中细胞成分呈生理状态下分散的游离状态，是流式细胞术分析的最佳样品，全血中含有红细胞、白细胞和血小板三种有形成分，流式细胞术检查以某组细胞为检测对象， 检测前应分离某组细胞，淋巴细胞制备采集肝素抗凝血2.0ml，用生理盐水2ml稀释全血4ml。 先将3ml的人淋巴细胞分离液放入另一个离心管中，将稀释后的血沿着试管内壁缓慢放入分离液面上，注意不要过度用力，以免血液和分离液混合，保持清晰的分层状态。 离心2000prm、30分钟、室温18-20、离心后试管内的血液清晰地分为4层，上层为血浆层，中层为分离液层(淋巴细胞位于血浆层和分离液层的中间)，底层为红细胞，红细胞上为粒细胞。 用吸管

13、吸引上层与中层之间的淋巴细胞，收集别的离心管，用生理盐水稀释为10ml，离心洗涤2次，每次1500prm，10分钟，丢弃上清可以得到纯度高的淋巴细胞，但有少量的单核细胞。 70%冰乙醇固定，放入4个冰箱保存。 粒细胞的制备是用淋巴细胞分离液将细胞分层。 由于粒细胞的比重比淋巴细胞稍大，因此被分离液分离的粒细胞在红细胞上分层，成为分离液的底部。 用吸管慢慢吸取颗粒细胞层，放入另一个离心管内，用5 ml hanks液洗涤3次，每次1500prm，离心沉淀10分钟。 吸收颗粒细胞的同时，附着红血球的情况很多，所以除去红血球，加入低渗透溶液1.0ml，30-40秒。 再用Hanks液洗涤2次，可以得到

14、纯度95%以上的粒细胞。 单核细胞制备1 .取肝素1000u/ml抗凝全血3.0m1，加入生理盐水3.0ml稀释血液，均在无菌条件下操作。 2.1640培养液10.0ml，放入培养瓶中，将稀释血放入培养液中搅拌，与培养瓶的接触面大。 放入3.37恒温槽内孵化30-40分钟，取出培养瓶，注入血液，用生理盐水轻轻冲洗培养瓶，除去残留的血液，此时培养瓶的壁上粘贴大量的单核细胞，单核细胞具有在短时间培养期内粘贴快的特征，其他细胞没有这个特征4 .消化培养瓶壁上附着的单核细胞，用0.25%胰酶消化1015分钟，在室温下，并不断摇晃，促进细胞脱落，单核细胞粘附力强，用酶消化细胞数少，目前仍采用机械方法，用

15、橡皮，装入培养瓶5 .脱落的细胞6 .涂上细胞，用氮丙啶橙染色，荧光显微镜下观察形态和纯度。 7 .用70%的乙醇固定细胞，放入0-4冰箱保存准备检查。 三、脱落细胞单细胞悬液的制备在临床实际工作中可以收集大量的自然脱落细胞，这些细胞标本经过简单的处理可以得到较好的单分散细胞悬液，因此是流式细胞术检测的天然样品，现将常见的脱落细胞样品的制备方法介绍如下。 宫颈脱落细胞悬液的制备1 .首先用生理盐水清洗宫颈表面的分泌物，用海绵轻轻擦拭宫颈表面，将海绵吸附的脱落细胞溶出到生理盐水20ml中。 2 .取细胞悬液，以1500prm离心沉淀，用生理盐水洗涤2次，每次5分钟，丢弃上清后加入70%乙醇3ml

16、固定检查。 食道脱落细胞悬浊液的制备1 .将食道网络上的细胞在10ml的生理盐水中洗脱，以1500prm离心沉淀，用生理盐水洗涤2次，离心500-800prm1-2分钟，丢弃上清。 2 .细胞数调整为1X106/ml，标记染色机可进行，若不及时检查，可固定保存70%的冰乙醇。 3 .标记染色前发现细胞团块聚集时，可用0.5%胃蛋白酶(PH1.5-2.0)在37水浴箱中消化5-10分钟，振荡分散在单细胞悬浮液中。 胸腹水脱落细胞的制备1 .提取胸腹水200-300ml，加入抗凝固剂(肝素或柠檬酸钠)5ml，放入容器中静置4个冰箱，放弃上清。 2 .留下沉淀液10-20ml，吸入试管内，用生理盐水洗涤3次，以1500prm离心沉淀5分钟。 3 .离心沉淀后，加入5ml冷柠檬酸缓冲液，在室温下放置20分钟。 用4.300目筛过滤后，用PBS洗净柠檬酸缓冲液，离心沉淀