蛋白质检测方法ppt课件.ppt

1、蛋白质检查研究进展，1，Contents，1，蛋白质介绍2，蛋白质检查方法3，蛋白质与疾病的关系，2，蛋白质介绍，蛋白质是氨基酸脱水收缩形成的空间结构复杂的大分子有机物，主要是化学元素C(约50%)，O(氨基酸是蛋白质的基本构成聚合物、两性离解和等电点、水合作用、变性作用、显色反应(双轴反应、波林酚反应、茚三酮反应、米伦反应、黄蛋白反应、乙醛酸反应、汉口反应、偶氮酶联免疫吸附试验常规方法：物理方法：紫外线吸收法化学法：凯比色法高效液相色谱法毛细管凝胶电泳方法近红外频谱质谱法荧光法，4，免疫印迹法，原理：蛋白质样品被传记电泳分离并转移到膜上固定，应用抗原抗体反应进行特异性检查的方法。Wester

2、n杂交是一种结合蛋白质传记游泳、印迹、免疫测定的特异性蛋白质检测方法，免疫印迹法也是蛋白质混合溶液中特定目的蛋白检测的定性方法。同一蛋白质也可以作为决定其他细胞或同一细胞相对含量的半定量方法。5，免疫印迹法是样品中特异性蛋白质的基本过程，样品的凝胶电泳，蛋白质印迹，封闭反应，特异性抗体(一元)孵化，与酶相关联的二项式孵化，发色或化学发光现象，最后，添加酶促反应基质，根据基质被酶催化的颜色和光学密度(OD)值的大小(OD)进行定性或定量分析。优点：灵敏度高。特异性好，简便重复性好。ELISA和Western杂交都利用抗原抗体之间的分子识别作用，徐璐通过其他抗体分子标记实现蛋白质检测。7，紫外线吸

3、收法，理论基础：蛋白质分子的酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸残基可在280 nm处吸收紫外线，吸光度与蛋白质含量成正比。另外，蛋白质溶液的238 nm吸光度值与肽键含量成正比。可以利用特定波长下蛋白质溶液的吸光度值与蛋白质浓度的比例关系来测定蛋白质含量。优点：简单、敏感、快速，不消耗样品，测定后缺陷：的准确度低，特异性低，干扰物质多，样品中含有能吸收嘌呤、嘧啶、核酸等紫外线的物质，那么大的干扰，8，凯西氮法，理论依据：各种蛋白质蛋白质样品用浓硫酸消化后硫酸铵，硫酸铵中的NH4和克氏定氮法是蛋白质在体内的主要氮物质，因此，通过测定生物样品中氮的含量，可以估算样品中蛋白质的总含量。蛋白质含量氮含量6.25

4、牙齿方法的测定范围为0.21.0毫克氮。优点：应用范围广，再现性好，准确度高的缺点：样品中总蛋白质检测，破坏蛋白质结构，在测试的样品中易受其他有机含氮化合物干扰，9，比色法-双轴法，原理：蛋白质有3个以上的肽键，因此在双轴(NH2-CO)碱性条件下，培养肽键双缩试剂及与其他种类蛋白质反应产物的颜色差异很小，因此牙齿方法更适合于总蛋白质检测。优点：操作简单，测量速度快的缺点：灵敏度低，准确度低，10，比色法-福林-苯酚试剂/Lowry方法，原理：1，蛋白质在碱性条件下与试剂甲的Cu2形成复合物。2.蛋白质中含有芳香氨基酸残基(如Tyr和Trp)而产生的复合物可以生产钼蓝和钨蓝复合物，因为试剂B(

5、富林酚试剂)的磷钼酸和磷钨酸。牙齿复合物在蓝色、颜色浓度和蛋白质浓度一定范围内具有线性关系，可用于定量分析。优点：反应灵敏，检查限度低，更适合微量蛋白质的测定缺点。在富林-苯酚试剂碱性条件下非常不稳定，因此必须准确地控制工作时间，容易受到酚类、糖类、尿素等多种物质的干扰。另外，由于不同蛋白质的酪氨酸和色氨酸含量不同，在不知道蛋白质种类的情况下，测量结果会出现部分偏差。11，比色法-BCA法，双环酸(BCA)试剂主要成分为异喹啉酸钠。BCA不是与蛋白质直接产生化学或物理反应，而是加强缩脲反应。BCA易于与Cu结合形成紫色复合物，牙齿复合物在562 nm处具有最大吸收峰，入射光的吸收程度与Cu浓度

6、成正比。12，比色法-BCA方法，优点：稳定性高，显色敏感性高，显色敏感性类似于福尔马林酚法，不受洗涤剂、变性剂影响的缺点：反应速度慢，容易被糖类、尿素、B2甲醇等物质干扰。2.comas亮蓝色G-250在自由状态下为红色，吸收棒位置约为488 nm，容易与蛋白质中的正酰胺和酰胺残留相结合，结合后颜色蓝色，最大吸收棒的位置转移到595nm。优点：结合稳定性、反应速度、发色灵敏度、操作简便，对酚类、玻璃氨基酸、络合剂等成分的干扰缺点：因蛋白质不同，氨酸和赖氨酸残基的含量不同，因蛋白质不同而强、弱，测定其他蛋白质时存在很大偏差。14、比色法-茚三酮方法可用于水解蛋白检测。15，比色法-茚三酮，氨基

7、酸，首先弱酸性加热条件下氨基酸水合茚酮氧化反应，氨基酸脱氨基和羟基脱醛类化合物，水合茚三酮吸收氨基脱醛胺合茚三酮。此后，胺合茚三酮及茚三酮反应产生了石磺，最终形成紫色蓝色或黄色、褐色化合物，产物颜色的深浅和蛋白质的浓度相关，最大吸收波长为570 nm左右。优点：非常高的发色灵敏度和良好的检测限度缺点：手语茚三酮和氨基酸发色程度不同，因此蛋白质水解程度不同，测量结果可能会产生很大的误差。另外，由于茚三酮显色剂的稳定性不好，器官存储，16，高效液相色谱法，原理：1，两相组中，利用热力学分配系数和力学扩散系数差异，混合组分离2，不同物质的溶解度，蒸气压，吸附能力等物理化学性质的差异，流动相和固定相之

8、间的分配系数不同，两相相对运动时，样品组在两相之间连续分配多次，最终各分其分离柱寿命、分离效率、分析时间短、样品杨怡少、传感灵敏度高的缺点：组成单位相似、分子极性相似、分子大小差异动植物蛋白质组分离效果差、17、近红外光谱、原理极性共价键(极性)选择性吸收特定波长的光，产生振动能级跳跃。吸收光子的频率和转换前后的能量差异相关，吸收强度取决于化学键振动的非协调性。分子的基本频率振动产生的吸收光谱位于波长2500-25000nm的中红外区域，短波近红外区域1100-2500nm的长波近红外区域的吸收光谱与基本频率振动的倍频和组合频率相对应。含有氢基团(X-H)的振荡电非调和常数最高，在有机物的近红

9、外吸收光谱中占主导地位。优点：绝大多数有机物具有吸收反应，测定时样品预处理的缺点很少。吸收系数小，检查限度通常低于0.1%，不利于蛋白质测定分析。18，质谱法，原理：质谱分析法是将化合物形成为聚离子和碎片离子，根据离子的质量比(m/z)形成化合物。如何分析化合物的成分和结构质谱分析的一般过程是，样品通过适当的注入装置引入汽化，汽化样品进入离子源后电离，电离离子适当加速，进入质量分析器，根据不同m/z分离，到达探测器并产生不同的信号，利用专门的生物软件进行后续分析。优点：准确性、灵敏度、基于质谱的蛋白质组学技术比传统的生物技术手段更适合临床疾病的研究缺点。技术发展不完美，第19条，毛细管凝胶电泳

10、，原理：传记风洞是电迁移，溶液中带电粒子电场产生的移动运动，运动的移动率，成分分子的大小，极性毛细管传记英东也称为毛细血管电分离，是以毛细血管分离通道，高压直流电场为动力，根据带电粒子移动率实现分组分离的液相分离技术。毛细管里充满凝胶介质的传记神童被称为毛细管凝胶电泳。在传记游泳过程中，随着电场的作用，传记游泳移动发生时，网状凝胶的干扰作用不同，移动速度发生变化，最终分离。(威廉莎士比亚、传记、传记、传记、传记、传记、传记、传记、电、电)的优点：分离度很高，分离速度快，样品消耗量低(样品消耗量为nL级)，缺点是。分离检验成本高，大分子容易堆积，清洗困难，再现性差，20，荧光法，荧光探针灵敏度高

11、，选择性好，体积小。体内活性小分子及金属离子干扰等优点可以在基于小分子荧光探针检测蛋白质小分子与蛋白质的相互作用后，引起小分子荧光光谱和蛋白质本身的荧光内源荧光光谱和同时荧光光谱的变化。可以提供荧光强度和偏振度的变化、新荧光棒的出现等小分子和蛋白质的结合信息。有两种茄子情况，由于小分子和蛋白质的作用，系统荧光性质发生了变化。小分子没有荧光，在蛋白质溶液中加入小分子的话，蛋白质的内源荧光就会使小分子发出荧光，蛋白质和小分子作用的话，内源荧光就会关闭，小分子的荧光放大，21，基于蛋白质疏水作用。在收购中，球形蛋白质的折叠总是有疏水残基包装的倾向。疏水作用和亲水性平衡在蛋白质结构及功能方面起着重要作

12、用。利用极性敏感有机小分子荧光探针，在与蛋白质结合前后，基于疏水空腔提供非极性环境，引起探针荧光性质的变化。22、在蛋白质和有机染料结合的基础上，蛋白质和荧光染料结合，溶液荧光强度可以增强或淬火，其变化量与蛋白质浓度成正比。有机染料包括血管黄素、西红Y、铬天蓝S、溴酚蓝、4羧基苯基卟啉、埃文斯蓝、偶氮染料、方酸菁染料、酞菁染料等，西红Y铬天蓝S、23、溴酚蓝、4羧基苯基卟啉、小分子荧光探针进行荧光能量共振传输分子内电荷转移(intra molecular charge transfer，ICT)选择性地识别蛋白质，26，根据自组装机制检测蛋白质超分子化学。分子集体结构和功能旨在研究基于分子弱相

13、互作用的组装、自我组装、自组织行为，并研究它们，超分子组装的实现依赖于分子间键。这包括氢键、范德华力、亲脂-疏水作用、金属离子的配位键、-累积作用等。Palapuravan Anees，Etal.j.am.chem.soc.200比色/比荧光探针检测蛋白质催化氨基甲酸酯保护团合成反应型探针，BSA的存在增强了氨基甲酰胺的绿色荧光，根据溶液颜色变化和荧光强度比例进行识别和定量检测。X. zhang.et al.analyst，2011，136 (19) :4008-4012。28，荧光有机纳米材料检测蛋白质纳米材料，三维空间中至少有一维是纳米尺度范围普通材料和与个别分子具有不同特性的纳米材料特殊

14、结构，主要包括比表面积大、化学活性、特殊光、传记、磁性等。荧光纳米材料，其特殊结构和光学特性为化学、物理、医学和生物学领域的发展带来了新的机会。29，半导体量子点量子点是主要由-族和-族元素组成的半导体纳米颗粒。量子点在蛋白质研究中有很多优点。第一，利用相同发生波长的光源，可以同时发生多个茄子不同荧光的量子点，由于发射光谱窄、对称，因此，不同颜色的发射峰不重叠，红移拖车容易发生，荧光光谱容易区分和识别。此外，量子点的斯托克斯位移较大，可以有效防止发生峰和发射峰的重叠，减少干扰。此外，量子点的光学特性可以通过控制反应条件，有效地控制量子点荧光的光学特性，为蛋白质多色标记和同步检测奠定了基础。30，嵌入式核-壳荧光纳米颗粒嵌入式核-壳荧光纳米颗粒是指装载有机荧光染料分子的无机纳米颗粒或聚生物大分子包合型纳米颗粒。牙齿材料在蛋白质标记成像中有其独特的优点。第一，纳米颗粒对包裹在内部的荧光染料有保护作用，提高荧光稳定性，克服对外部环境牙齿荧光物质的影响。第二，由于包裹在纳米颗粒内的荧光分子达数千到数万个，因此更多的荧光分子可以连接到生物分子上，在信号反应时，很多荧光分子同时产生荧光信号，信号扩大的作用提高了检测灵敏度。31、碳点碳点是接近球体、直径小于10 nm的零维半导体纳米晶体。(威