课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数.pptx

1、课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,专题二 微生物的培养与应用,尿素的利用,1,细菌能利用尿素的原因,2,课题目的,3,课题背景,尿素的利用,1,尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。,细菌能利用尿素的原因,2,土壤中的细菌能分解尿素是因为它们能合成脲酶。,课题的目的,3,从土壤中分离出能够分解尿素的细菌,统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌,筛选菌株,1,统计菌落数目,2,设置对照,3,研究思路,筛选菌株,1,1.实例：寻找耐高温的DNA聚合酶,DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐

2、高温（930C）的DNA聚合酶。,耐高温的酶,寻找,耐高温生物体,寻找,高温环境（热泉、火山口）,启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。,2.微生物的筛选原理,自然界筛选 寻找目的菌种时要根据它对_的要求，到_的环境中去寻找。,实验室筛选 人为提供适合_生长的条件（包括营养、温度、PH等），同时_其他微生物生长。,生存环境,相应,目的菌株,抑制或阻止,2.微生物的筛选原理,要分离某一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等配制培养基。 方法：抑制大多数微生物，使其不能生长。 造成有利于该菌生长的环境。 结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过

3、平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。,3.选择培养基,选择培养基：在微生物学中，将允许 种类的微生物生长，同时 和_其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。,特定,抑制,阻止,KH2PO4 1.4g NaHPO4 2.1g MgSO4 H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g 琼脂 15.0g 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL。,该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？ 此配方能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？,碳源：葡萄糖、尿素,氮源：尿素,能；只有产生脲酶的细菌能利用尿素作为氮源而生存。,选择培养基,选择培养基选择分解尿素的微生物的原理,

4、该选择培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。,统计菌落数目,2,1.显微镜直接计数,利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量的方法。,缺点,不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察。,显微镜直接计数,2.间接计数法（活菌计数法）,原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。 常用方法：稀释涂布平板法

5、。,每克样品中的菌落数(CV)M C：某一稀释度下平板上生长的平均菌落数； V：涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)； M：稀释倍数。,（3）注意事项,为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板上进行计数。 为使结果更准确，可将同一稀释度涂布三个或三个以上的培养皿中，培养计算出菌落平均数。 统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。 涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般以三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌落数在50个左右为最好。,设置对照,3,1.设置对照实验的目的： 排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。 对照实验是指除了 被测试 的条件外，其他条件都 相同

6、的实验。,实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因。,原因：土样不同； 培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质),方案一：由其他同学用与A同学相同的土样进行实验。,结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。,方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。,小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。,土壤取样,

7、1,制备培养基,2,样品的稀释与涂布,3,实验操作,微生物的培养与观察,4,土壤取样,1,取样条件：从肥沃、富含 _的土壤表层，酸碱度接近 且潮湿的土壤取样。 取样部位：距地表约 cm的土壤层。,有机质,中性,38,从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。 取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。,制备培养基,2,制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。,制备牛肉膏蛋白胨培养基。,相同的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。,样品的稀

8、释与涂布,3,注意事项： 应在火焰旁称取土壤10g。 在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行。 分离不同的微生物采用不同的稀释度。 原因：不同微生物在土壤中含量不同 目的：保证获得菌落数在30300之间、适于计数的平板,实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。 如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。,微生物的培养与观察,4,培养不同微生物往往需要不同培养温度。 细菌：3037培养12d 放线菌：2528培养57d 霉菌：25

9、28的温度下培养34d。,在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。 选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。,不同种类的细菌形成的菌落，在大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等方面具有一定的特征，菌落特征可作为菌种鉴定的重要依据。,结果分析与评价,1.培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落？,答：对照的培养皿无菌落说明培养基没有污染。 牛肉膏培养基的菌落数目多于选择培养基的菌落数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。,2.获得某一稀释度下，有菌落数30300的平板，在这一稀释度下是否至少有两个平板的菌落数相接近？,答： 相接近，说明操作成功。,

10、操作注意事项,无菌操作 1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。 2、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。 3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。,做好标记 注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。 制定计划,课外延伸,在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。,在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成氨。氨会使培养基碱性增强，PH升高。因此，我们可以通过检测培养基的PH变化来判断尿素的分解反应是否发生。,测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红-美蓝 培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记算得出水样中大肠杆菌的数量。,本课题知识小结:,巩固练习,1.使用选择培养基的目的是 （ ） A.培养细菌 B.培养真菌 C.使需要的微生物大量繁殖 D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别,C,2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是 ( ) A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3 C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素,D,3