药物研发与毒性筛选(20151130).ppt

1、药物研发与毒性筛选,黄 芝 瑛,Tel39943092,E-mail: ,药物的基本要求,安全、有效、质量可控,药理学,毒理学,毒理学的研究领域,发现和识别外源性毒物的“潜在危害”的“证据”,探讨作用原理，为解毒和安全使用提供“理论基础”,系统的毒性研究，明确安全性范围。评价,危险度评估和管理法规及措施的制订。,描述性毒理学,毒理机制,应用毒理学,管理和控制,21世纪毒性试验的发展,毒性通路,针对性试验,毒性试验,外源毒物的识别,剂量反应建模与外推建模,风险背景,人群数据和暴露数据,毒性通路,21世纪毒性实验分类,针对性试验,评价毒性通路的紊乱，而非顶端终点； 强调采

2、用细胞或细胞系，尤其是人源 细胞的高通量试验方法； 采用中通量实验法评价细胞的整体反应,开展相关的实验，以评价代谢物、评估靶组织或者在基因组水平上进一步了解受到影响的细胞过程； 限制体内研究的种类和期限，重点关注暴露时间不超出14天的研究； 依据最新的化学品分类法，对代表性的受试物作更为详尽的测试,内源性激素 (Endogenous hormones) DNA损伤 (DNA damage) 抗氧化剂反应（Antioxidant Response Pathway） PXR、 CAR、PPAR和AhR受体 (PXR, CAR, PPAR and AhR receptors) 低渗 (Hypo-os

3、molarity) Nrf2 氧化应激 (Nrf2 oxidative stress) 热休克蛋白 (Heat-shock proteins) P38MAPK (P38 MAPK) 。,已知的主要的毒性通路,新药研发的技术模式和研究路径的转变,Strategy and Implementation Plan for Advancing Regulatory Science for Medicinal Products。2013，USFDA 8个领域中的第一个：毒理学的现代化，促进革新基于动物实验的传统安全性评价方法，具体包括： 开展安全性评价新方法研究：特别是基于生物标记物的评价技术。例如，将

4、细胞、基因芯片、蛋白质组学和代谢组学数据与动物实验、临床研究整合。 体外实验以及计算机辅助建模方法的研究 细胞株、遗传工程改造的生物组织模型等方法的开发,发现毒理学研究,药物研究早期发现阶段，通过毒理学筛选和评价，及早地发现和淘汰有严重毒性问题、不适合开发的化合物，指导合成更安全有效的化合物。,意义 药理和毒理学家同时采用快速、低耗、高通量筛选系统对一系列新化学物进行药效和毒性的同步筛选，找出候选化合物。 确定NCEs的毒性作用机制和定量构效关系, 指导化学家合成毒性较低的系列化合物。 毒理学家基于该类化合物的毒性机制选出合适的体内动物实验模型，进行体内毒性评价。,减少动物，提高成功率,降低费

5、用，缩短周期,特点,涵盖的毒理学终点广 试验方法敏感性高 使用的样品量少 试验周期短 试验技术方法易于掌握，试剂及仪器费用低 有效降低新药研发的费用，加快研发进程 不受GLP约束,主要技术手段,药物毒性的早期优化筛选系统（Preclinical Lead Optimization Technologies, PLOTs) 计算机模型或专家系统预测新化学实体的潜在毒性QSAR， in silico toxicology “基因修饰”动物模型评价候选新药的毒性、致癌性及其毒作用机制 毒理组学(-omics)技术研究药物的毒性机制,1、药物毒性的早期优化筛选系统 （Preclinical Lead

6、Optimization Technologies, PLOTs),1)、一般毒性,体外试验 MTT法：线粒体脱氢酶活性 XTT法 ：线粒体脱氢酶活性 CCK-8法 ：线粒体脱氢酶活性 LDH法 ：细胞膜的完整性 中性红法 ：将染料摄入溶酶体的胞吞作用 刃天青法 ：细胞的代谢活性 苔盼兰排斥试验：细胞膜的完整性 体内试验 上下法,肝细胞毒性试验,离体肝灌流：评价药物毒物在肝脏的代谢动力学，代谢产物情况，对肝脏的毒性作用以及对肝脏代谢酶的影响等 精密切割的肝切片 肝细胞培养：人肝细胞、大鼠原代肝细胞、HepG2细胞系 离体的亚细胞成分 胚胎干细胞（ES）定向分化成的肝细胞样细胞模型： 利用人胚胎

7、干细胞分化的肝细胞，一方面通过比较蛋白含量测定（KB分析），细胞活性测定（MTT分析）观察药物对肝细胞增殖的影响；另一方面，选择受试药物刺激肝细胞，检测肝功能相关酶ALT、AST、ALP、LDH等；其三，检测细胞色素p450酶活性，观察药物对其影响。,ADME/T模型及药物相互作用模型(CYP450s、Pgp、Caco-2、Cocktail),应用Caco2细胞模型评价药物和毒物的吸收情况、重复用药对药物吸收的转运蛋白的影响、药物对肠道细胞的毒作用以及药物吸收的毒性成份等。 应用肝微粒体孵育“cocktail”技术，根据药物在肝微粒体中的消除速率以及在各种与药物代谢密切相关的P450 酶亚型(

8、如CYP1A2、2C9、2C19、2D6、3A4等)特异性抑制剂存在下的消除速率差异研究，判断何种酶亚型可能参与了该药的代谢。,心脏毒性筛选试验,hERG(human ether-a-go-go related gene)钾离子通道模型 基于hERG表达系统, 通过膜片钳技术观察hERG通道的电生理学特性,构建药物致QT间期延长体外评价模型,对hERG电流的影响,为药物致QT 间期延长的安全性评价提供技术手段。 膜片钳技术被称为研究离子通道的“金标准”。,心肌毒性：利用人胚胎干细胞分化的心肌细胞，通过比较蛋白含量测定（KB分析），细胞活性测定（MTT分析）观察药物对心肌细胞增殖的影响；,肾脏毒

9、性,体外： 离体灌注的肾脏 离体灌注的肾单位、肾组织切片 离体的肾小球、LLC-PK1、OK、MDCK、NRK-52E、HK-2细胞 体内： 早期肾损伤的生物标志物： KIM-1、白蛋白、总蛋白、2-微球蛋白、胱蛋白酶C（Cystatin C）、聚集素（Clusterin）、三叶因子-3（Trefoil Factor-3）,2)、遗传毒性,Ames波动试验 Green-Screen assay:利用酵母DNA修复基因RAD54和报告基因构建 利用P53报告基因构建 体外微核 小鼠淋巴瘤细胞试验(Mouse Lymphoma Assay, MLA) 彗星试验,3)、生殖毒性,全胚胎培养 (WEC

10、) 中脑细胞微团培养(MM) 胚胎干细胞试验(EST),4)、局部毒性,皮肤刺激： TER, EPISKIN, EPIDERM、ORROSITEX 光毒性 : 3T3 NRU-PT 眼刺激：经体外兔去核眼刺激试验 (Ex-RET) 、眼人组织等价试验 (EpiOcular)、牛经体外角膜混浊透过试验 (BCOP)、鸡经体外去核眼刺激试验 (CEET) 皮肤过敏：局部淋巴结试验(LLNA)、肽反应性试验 Alternative toxicity assay,高通量毒性筛选 (HTS),高内涵毒性筛选,检测被筛样品对细胞形态、生长、分化、迁移、凋亡、代谢途径及信号传导的影响，在实验中获取大量相关信

11、息。 筛选模型：人类及啮齿动物相应靶器官（肝、肾、心脏和神经系统）的体外培养细胞 检测指标：细胞丢失、DNA降解、核大小、细胞骨架紊乱、DNA损伤反应、氧化应激、有丝分裂指标、应激激酶激活、线粒体功能、细胞周期阻滞,成像技术的应用,MRI =磁共振成像; CT =电脑断层扫描; USG = 超声波扫描术y; MRSI =磁共振波谱成像; PET =正电子成像术; SPECT =单光子发射计算机断层扫描; IR = 红外; fPET = 功能性正电子成像术; fMRI =功能性磁共振成像; OI = 光学成像,非侵袭/动物数量减少 同一动物的发育 衰老 动物用作自身对照 同一动物的每天多项研究

12、平行进行解剖和机能评价,2、计算机模型或专家系统预测新化学实体的潜在毒性QSAR， in silico toxicology,药物早期虚拟筛选程序,用计算机筛选的方法称为虚拟筛选，或称in silico筛选 ，成为in silico-in vitro-in vivo模式 。 用一系列“基于知识的滤网”对虚拟库“筛选”，以“浓缩”出能够满足预定标准的化合物。 这些滤网包括类药性(drug like)，药代动力学性质，毒性，知识产权问题以及与受体的互补性或与配体的相似性等，是通过数据库搜寻和计算化学实现的。,计算机辅助药物毒性筛选模型,P450酶,抑制剂与P450s的相互作用模型,分子对接和动力学

13、模拟,结合自由能预测,化合物的构效关系模型,化合物的结构和活性（毒性）,计算机辅助药物毒性筛选模型,计算机模型或专家系统,Commercially available toxicity estimation packages are available to predict a variety of toxic endpoints including mutagenicity, carcinogenicity, teratogenicity, skin and eye irritation and acute toxicity: DEREK (Deductive Estimation of R

14、isk from Existing Knowledge) - www.chem.leeds.ac.uk/luk HazardExpert CASE (Computer Automated Structure Evaluation) TOPKAT (Toxicity Prediction by Computer Assisted Technology) OncoLogic DILIsim - drug induced liver injury (DILI),Tox Effects in Drug Design,Tox Effect Acute (LD50) Organ-specific effe

15、cts Mutagenicity Reproductive effects Carcinogenicity,Programs Topkat, AB/LD50 AB/Tox* (next version) Many programs, AB/Tox Many programs, AB/Tox* Many programs, AB/Tox*,3、 “基因修饰”动物技术（ 转基因、基因敲除、人源化基因敲入动物 ）的应用,转基因和基因敲除动物模型：肝毒性,Hsp70i基因敲除小鼠模型 金属硫蛋白（MT）-I/II敲除小鼠 谷氨酰转肽酶缺乏小鼠 Nrf2基因敲除小鼠 Sod2+/-杂合子Knockout小鼠模型,rasH2 转基因小鼠模型 TgAC 转基因小鼠模型 p53+/-基因敲除小鼠模型 XPA +/-基因敲除小鼠模型 XPA +/- / p53+/-基因敲除小鼠模型 新生小鼠试验(CD-1 或B6C3F1小鼠),转基因和基因敲除动物模型：致癌试验,4、毒理组学(-omics)技术研究药物的毒性机制,通过分析基因、蛋白质表达和代谢成分的差异，可以预测出新药的毒作用机