血流感染实验室诊断

1、血流感染实验室诊断新进展,北京协和医院检验科 王瑶 2013年4月13日,内容,什么是血流感染？ 血流感染流行病学特点 血培养流程优化 提高阳性率 分析培养结果 减少污染 分子生物学方法检测血流感染 基于PCR的技术 MALDI-TOF MS PNA-FISH,概念,感染炎症+病原体 全身炎症反应综合征（SIRS） 体温38C或90次/分 呼吸频率20次/分，或PaCO212109/L或10% 脓毒血症（sepsis）感染+SIRS，血培养可以阳性或阴性 重度脓毒血症（severe sepsis）sepsis+脏器功能障碍、组织灌注不良和低血压 感染性休克（septic shock）,概念,败

2、血症（septicemia）：病原菌及其毒素侵入血流所引起的临床综合征，是一种严重的全身感染。病原菌主要是细菌，也可为真菌、分枝杆菌等。 菌血症（bacteremia）：细菌在血流中短暂出现的现象，一般无明显毒血症状，在国外文献中常与败血症通用。 血流感染（bloodstream infection, BSI）：败血症和菌血症目前统称为血流感染。,血流感染,医院获得性血流感染 原发血流感染 实验室证实血流感染（Laboratory-confirmed Bloodstream Infection, LCBI） 临床血流感染（Clinical Sepsis） 继发血流感染：血培养分离出有意义微生物

3、，而且此微生物与另一部位之院内感染有关。唯不包括血管或血管内导管装置所引起之血流感染。 社区获得性血流感染,实验室证实血流感染（LCBI）,标准一：从一次或多次血标本中培养出一种一致的致病菌，而且培养出的病原体与其它部位的感染无关。 标准二：病人至少具有下列症状和体征之一：发热（38 C ），寒颤或低血压，并致病符合下列之一： 1.从两次或两次以上不同部位抽血的标本中培养出皮肤寄生菌（如类白喉杆菌、芽孢杆菌、丙酸杆菌、凝固酶阴性葡萄球菌或微球菌）。 2.至少一次从带血管内导管的病人血标本中培养出皮肤寄生菌群（如类白喉杆菌、芽孢杆菌、丙酸杆菌、凝固酶阴性葡萄球菌或微球菌），并且主管医生开始了适当

4、的抗菌药物治疗。 3.血中抗原检测阳性（如流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌或B群链球菌）。与实验室阳性结果一致的症状和体征与其它部位的感染无关。 标准三：年龄38 C ），低温（37 C ），呼吸暂停、脉搏徐缓，并具有下列之一（同上3点略）,临床血流感染（Clinical Sepsis）,具有下列二条件之一者： 具有非其它已知原因所引起的发烧、血压过低（收缩压90mmHg或收缩压低于平常超过40mmHg），少尿（每小时尿量低于30ml）等临床症状任何一项，且符合下列所有条件者： 未做血培养，或血培养阴性或血液抗原反应呈阴性者 其它部位无明显感染者 医生针对此感染中毒症状给予适当抗菌药物治

5、疗 1岁以下婴儿 ，具有非其它书籍原因引起的发烧、体温过低、呼吸中止或心跳过缓等临床症状任何一项，且符合下列所有条件者： 未做血培养，或血培养阴性或血液抗原反应呈阴性者 其它部位无明显感染者 医生针对此感染中毒症状给予适当抗菌药物治疗,BSI流行病学特点,BSI发病率逐年增加 凝固酶阴性葡萄球菌、肠球菌、真菌血流感染发病率逐年上升，革兰阴性菌下降 耐药菌比例逐年增加 社区获得与医院获得血流感染病原谱存在差异 院内BSI患者病死率高,美国脓毒血症流行病学,Martin et al, NEJM 2003;348:1546,加拿大CANWORD监测2002-2009,Diag Microbiolo

6、Infect Dis. 2011; 69: 307,加拿大CANWORD监测2002-2009,Diag Microbiolo Infect Dis. 2011; 69: 307,美国49医院BSI病原谱,CID. 2004, 39: 309-317,PUMCH2012年834血培养分离株,PUMCH2012年144株BSI大肠埃希菌药敏结果,ESBL 60.2%,PUMCH2012年67株BSI肺炎克雷伯菌药敏结果,ESBL 34.4%,PUMCH2012年61株BSI鲍曼不动杆菌药敏结果,PUMCH2012年76株BSI金黄色葡萄球菌药敏结果,PUMCH2012年46株BSI草绿色溶血链球

7、菌药敏结果,2011CHIF-NET489株BSI酵母菌,2011CHIF-NET念珠菌对氟康唑的敏感性,2011CHIF-NET念珠菌对伏立康唑的 敏感性,2011CHIF-NET其他酵母菌对氟康唑的敏感性,2011CHIF-NET其他酵母菌对伏立康唑的 敏感性,采血量是影响血培养阳性率的独立相关因素,CLSI M47-A：每位患者采集23套血培养（4060ml） Surviving Sepsis Campaign Guidelines (Worldwide)：抗菌药物治疗前至少采集2套血培养 英国NHS血培养标准：采集2套血培养,采血量对血培养阳性率的影响,JCM 2007,采血量对血培养

8、阳性率的影响,J. Clin. Microbiol. 2011, 49(12):4047,J. Clin. Microbiol. 2011, 49(12):4047,Routine Set Mayo Clinic: 2 BACTEC Aerobic Plus Bottles + 1 BACTEC Anaerobic Lytic Bottle,采血量和阳性率,27,非条件致病菌,28,在多次血培养中单次培养下列细菌阳性 凝固酶阴性葡萄球菌 棒状杆菌 微球菌 丙酸杆菌 芽孢杆菌 如多次培养阳性，可能为条件致病菌，需结合临床分析,血培养污染菌,非条件致病菌,Mayo Clinic,(p0.001),

9、为什么需氧+厌氧？,29,Pathogen No.,两种组合均能检测,不同的病原菌,J. Clin. Microbiol. 2011, 49(12):4047,表皮葡萄球菌血培养阳性意义,CID 1997,血培养阳性时间凝固酶阴性葡萄球菌,96%(+) 86%单瓶（）,需氧瓶242 厌氧瓶72 需厌150,血培养阳性时间金黄色葡萄球菌,如何分析血培养凝固酶阴性葡萄球菌？,University Hospital of Base，20032007 3060阳性血培养，654CNS，粒缺患者除外 232 (35%)真正BSI，422 (65%)污染 BSI由感染科医生判断，至少一份血培养CNS阳性，

10、有感染临床表现 SIRS: 体温38C or 90/min; 呼吸 20/min; 白细胞12 or 10% 未成熟中性粒细胞 32%患者有1瓶以上CNS阳性，BSI68 %，污染12% (p 0.001) 没有SIRS症状：BSI 5%，污染29% (p 0.001),Clin Microbiol Infect. 2012 online,单瓶血培养CNS的BSI和污染患者区别,Clin Microbiol Infect. 2012 online,单瓶血培养CNS阳性BSI与临床症状相关性,Clin Microbiol Infect. 2012 online,Clin Microbiol In

11、fect. 2012 online,降低血培养污染率严格消毒,血培养瓶消毒：70%酒精消毒血培养瓶橡皮塞,待干60秒。或70%异丙醇消毒干燥 皮肤消毒： 三步法 70%酒精擦拭静脉穿刺点 30秒 1%2%碘酊30秒或10%碘伏消毒60秒：从穿刺点向外画圈消毒,直径3cm 70%酒精脱碘 一步法 葡萄糖酸洗必泰作用30 s，或70%异丙醇消毒后自然干燥，但不适用于2个月以内的新生儿。,急诊血培养污染率与工作量相关,The University of Michigan Health System急诊 血培养大多数由采血员采集，其次为护士和医生 采血员:病人= 1:9，重症区护士:病人= 2:3，其

12、它区域护士:病人=1:4 年病人量82521人，采集血培养者7586人 11.4%至少1瓶阳性，病原菌阳性率8.0%，污染率3.7% 多套培养患者阳性率7.4%，单套培养阳性率5.1%（p0.001），污染率无显著差别（2.2% vs. 2.6%）,Schuyler Halverson, et al. JCM. 2013 online,急诊小时工作量,Schuyler Halverson, et al. JCM. 2013 online,繁忙时血培养污染率增加,OR=1.23,OR=0.93,Schuyler Halverson, et al. JCM. 2013 online,抗菌药物治疗与

13、血流感染死亡率,死亡率,Chest 115 (2): 1999,血培养三级报告制度,血培养 阳性,终报告,革兰染色,传种培养,初步报告 (直接药敏),鉴定菌株,电话报告,鉴定标准药敏,42,血培养结果回报对治疗的影响,A = Appropriate Therapy(正确治疗) I = Inappropriate Therapy(不正确治疗),Clin Infec Dis 24:584-602, 1997,血流感染快速分子诊断,分子诊断不受抗菌药物使用的影响 血培养阳性后分子诊断 直接使用血标本进行分子诊断 快速 但不能提供药敏结果,血培养阳性瓶分子鉴定,Antigone Kotsaki, et

14、 al. Expert Opin. Med. Diagn. 2012, 6(3):209,阳性血培养基于PCR的检测,PCR特异性检测 病原特异性PCR 特定耐药基因检测：葡萄球菌mecA, 肠球菌van 细菌载量：肺炎链球菌自溶毒A基因lytA拷贝数 广谱检测：PCR扩增特定靶位 多态性分析 测序 后续基因检测 种特异性real-time PCR,Expert Opin. Med. Diagn. 2012, 6(3):209. Curr Opin Infect Dis.2011, 24(2):137,qPCR鉴定血培养阳性瓶中铜绿假单胞菌,Target：ecfX gene 血培养系统：Bac

15、T/ALERT，87瓶FA、13瓶FN，涂片均显示G-b 对照方法：氧化酶，API 20E DNA提取：0.5ml肉汤，离心后加裂解液，水煮法 定量PCR： 扩增：Oligonucleotide primers 基因特异性检测：fluorescent-labeled hybridization probes，152bp fragment,Annal Clin Microbiol Antimicrob 2010, 9:21,47,qPCR鉴定血培养阳性瓶中铜绿假单胞菌,33瓶pae，敏感性和特异性均为100% 1瓶kpn+pae，由于pae (20CFU/ml)kpn (108CFU/ml)，P

16、CR(-) 检测限：将ATCC27853 ecfX基因克隆至TOP10 E.coli,Annal Clin Microbiol Antimicrob 2010, 9:21,48,阳性血培养基于PCR的检测,最常见病原体多重PCR 电泳谱、ELISA杂交、多重Real-time PCR Hyplex BloodScreen (BAG, Lich, Germany): 多重PCR+ELISA, 4.5-6h完成 Prove-It Sepsis (Mobidiag, Helsinki, Finland)：多重real-time PCR+微阵列分析，检测多种病原及mecA，3h完成 多重Real-ti

17、me PCR,Expert Opin. Med. Diagn. 2012, 6(3):209.,血培养阳性多重real-time PCR,NEW MICROBIOLOGICA, 36, 65-74, 2013,血培养阳性多重real-time PCR,NEW MICROBIOLOGICA, 36, 65-74, 2013,血培养阳性PNA FISH核酸荧光原位杂交,血培养阳性肉汤革兰染色PNA FISH,革兰阴性菌： 商品化试剂盒eco/kpn/pae Efa/其它肠球 Sau/scn Cal/cgl/其它念珠菌 报道Salmonella spp. 90min PNA FISH完成,Appl

18、Environ Microbiol. 2010 ;76:4476 J. Clin. Microbiol. 2013, 51(4):1301 J Clin Microbiol. 2009; 47: 247,52,MALDI-TOF MS,基质辅助激光解析电离（MALDI） 原理：将样品分散在基质分子中形成结晶后直接进样，当用激光照射结晶时，基质吸收了激光的大部分能量，使基质分子和样品获得能量投射到气相并得到电离，成为带电荷的离子。 基质在样品离子形成过程中起到了质子化或去质子化的作用，使样品带上正电荷或负电荷，成为带电荷的离子 基质会干扰被检测分子质谱峰的大小和浓度；不同类型的分析物选择不同的基

19、质,MALDI-TOF MS,飞行时间（TOF） 原理：离子源产生的离子在加速电场获得动能，当进入高真空无电场飞行管道并在此管道内飞行时，质量较轻的离子飞行速度快，早到达检测器；质量较重的离子飞行速度慢，晚到达检测器。因此依据离子的飞行时间与其质荷比平方根（m/z）成正比的关系，通过测定飞行时间，计算出相应离子的分子量。,MALDI-TOF MS操作步骤,MALDI-TOF MS快速鉴定阳性血培养,使用菌落、阳性血培养肉汤鉴定 快速：20分钟(从报警到鉴定出结果） MALDI-TOF MS(Bruker)+BACTEC(BD): 正确鉴定：193/213阴性菌（包括厌氧菌）(90.61%)，2

20、84/319阳性菌(89.02%) 80.9%复数菌正确鉴定出一种，7株缓症链球菌鉴定为spn MALDI-TOF MS(Bruker)+BacT/ALERT(bioMrieux): 388个阳性瓶，种正确率91%（包括念珠、厌氧菌） 15瓶复数菌：使用通用库多鉴定出一种，革兰染色后使用阴性或阳性库分析，6瓶鉴定出第二种菌,Clin Microbiol Infect 2010; 16: 1631J Clin Microbiol 2010; 48: 1542,56,MALDI-TOF MS,VITEK MS(bioMrieux) 以16s为金标准，980株临床分离株，ID正确率 肠杆菌科97.7

21、% 非发酵菌92% 葡萄球菌属94.3% 链球菌属84.8% HACEK84% 酵母菌85.2%,57,J Clin Microbiol. 2010; 48: 900,PCR/ESI MS,广谱PCRESI MS（电喷射质谱） 189阳性血培养和45阴性血培养，种一致率98.7% 6例spn标本方法阴性 提供定量结果评估病原体载量 假阴性率24%：几乎均由混合感染导致 5-6h完成检测 结合PCR的敏感性和ESI MS特异性 可以直接检测标本，不需要培养,Proc Natl Acad Sci. 2005;102:8012,血标本分子检测,种特异性、属特异性、广谱、多重PCR、微阵列分析 血培养

22、阴性的苛养菌，如Bartonella spp.巴尔通体, Coxiella burnetii伯氏考克斯体, Mycoplasma spp.支原体, Chlamydia spp.衣原体, Ricketssia spp.立克次体，Tropheryma whipplei,商品化分子生物学检测方法:血标本,SeptiFast(Roche)：multiplex real-time PCR，种属特异性荧光探针，检测重要血流感染致病菌 SepsiTestTM (Molzym)：eubacterial and panfungal real-time PCR， a 16S and 18S rRNA gene-based universal PCR+ sequencing，几乎可以鉴定所有细菌、真菌 VYOO (SIRS Lab)：multiplex PCR，检测重要血流感染菌，电泳分离扩增片段 Plex-ID (Abbott)：eubacterial and panfungal PCR+质谱，几乎可以鉴定所有细菌、真菌,60,Intensive Care Med. 2011 May, publish online.,SeptiFast test检测的病原谱,