第六章微生物发酵机理2.ppt

1、第四节代谢调节的人工控制,微生物的正常代谢不会使代谢产物过量积累，发酵目的是尽可能多地积累代谢产物，以此必须打破微生物的代谢调节机制，使代谢产物大量积累。,方法,改变微生物的遗传学特性,控制发酵条件,一改变微生物的遗传学特性,（一）.营养缺陷型和渗透缺陷型突变菌株的应用,1.营养缺陷型：原菌株由于发生突变，致使代谢途径中某一步骤发生缺陷，从而丧失了合成某种物质的能力，必须在培养基中外源补加该营养物质才能正常生长的突变菌株。,在培养过程中我们可以控制补加营养物质的量也不造成反馈调节（阻遏或抑制）。,如,A,B,C,D,E,限量添加E，就会造成C大量积累,枯草芽孢杆菌的精氨酸营养缺陷型，鸟氨酸积累

2、量可到到25g/L.,A,B,C,F,D,G,E,A,B,C,F,D,G,E,协同反馈,A,B,C,F,D,G,E,A,B,C,F,D,G,E,H,赖氨酸简介： 谷物中不含的必须氨基酸。,天冬氨酸,天冬氨酰磷酸,天冬氨酸半醛,赖氨酸,高丝氨酸,甲硫氨酸,苏氨酸,异亮氨酸,天冬氨酸激酶（AK),反馈抑制,反馈阻遏,谷氨酸棒状杆菌生产赖氨酸,高丝氨酸脱氢酶(HSDH),利用谷氨酸棒状生产赖氨酸比利用大肠杆菌的优势： （1）不存在天冬氨酸激酶或天冬氨酸半醛脱氢酶受阻遏的问题； （2）赖氨酸分支的第一和第二个酶（双氢吡啶二羧酸合成酶和双氢吡啶二羧酸还原酶）不受赖氨酸的抑制或阻遏； （3）赖氨酸产生菌中

3、缺少L-赖氨酸脱羧酶。,肌苷酸生成菌株,PRPP磷酸核糖基焦磷酸,IMP肌苷酸,S-AMP肌苷酸琥珀酸,AMP腺嘌呤5单磷酸,XMP黄苷酸,GMP鸟嘌呤5单磷酸,肌苷酸简介：很好的高效调味品，也是重要的工业原料。,产量达13g/L,2. 渗漏缺陷型(leaky mutant):,一种不完全遗传障碍营养缺陷型，能够自己合成某一代谢终产物但达不到反馈调节的浓度，所以不会造成反馈抑制而影响中间代谢产物的积累。 与营养缺陷型的区别？,（二）抗反馈调节突变菌株的应用,抗反馈调节菌株：对反馈抑制作用不敏感，或对反馈阻遏有抗性，或二者兼而有之的菌株。,抗反馈抑制突变菌株的获得途径：,1.结构类似物抗性突变菌

4、株,2.营养缺陷型回复突变菌株,获得方法及其原理：,结构类似物抗性突变菌株,将接除了反馈抑制的突变菌株筛选出来,A某种氨基酸,A某种氨基酸的类似物,A,经过突变处理的菌株,极少数,大多数,营养缺陷型回复突变菌株,获得方法及其原理：,催化亚基回复,催化亚基和调节回复,催化亚基完全回复,催化亚基未完全回复,抗反馈调节突变菌株与营养突变菌株比较：,1.不受培养基中营养成分的限制，生产稳定；,2. 易于筛选,3.可有效防止回复突变，易于保存,对于分支合成途径使用抗性突变菌株要和营养缺陷型结合育种，才会得到更高的产量。,葡萄糖,天冬氨酸,天冬氨酸磷酸,高丝氨酸,苏氨酸,AHVr,甲硫氨酸,Met -,赖

5、氨酸,Lys-,HD,AK,反馈抑制,反馈阻遏,黄色短杆菌 的苏氨酸合 成途径,抗代谢类似物的筛选方法,不含结构类似物,含结构类似物,3.抗分解阻遏突变体的应用,例如：葡萄糖脯氨酸，筛选抗分解阻遏突变体,利用葡萄糖类似物选育蔗糖酶、淀粉酶、纤维素酶,4.选育组成型突变株和超产突变株,如果调节基因发生突变，以至产生无效的阻遏物而不能和操纵基因结合，或操纵基因突变，从而造成结构基因不受控制的转录，酶 的生成将不再需要诱导剂或不再被末端产物或分解代谢物阻遏，这样的突变株称为 组成型突变株。少数情况下，组成型突变株可产生大量的、比亲本高的多的酶，这种突变株称为超产突变株。,组成型突变株,结构基因不受控

6、制地转录，酶的生成将不再需要诱导剂或不再被末端产物或分解代谢物阻遏。,调节基因发生突变,产生无效的阻遏物而不能与操纵基因结合,操纵基因突变,突变操纵基因不能与阻遏物结合,组成型突变,5.条件致死 例如在抗生素和酶制剂生产过程中的应用。,6.细胞膜通透性突变体的应用,使胞内的代谢产物迅速渗漏出去,解除末端产物的反馈抑制。 1. 用生理学手段 直接抑制膜的合成或使膜受缺损 如: 在Glu发酵中把生物素浓度控制在亚适量可大量分泌Glu； 控制生物素的含量可改变细胞膜的成分，进而改变膜透性； 当培养液中生物素含量较高时采用适量添加青霉素的方法； 再如：产氨短杆菌的核苷酸发酵中控制因素是Mn2+； Mn

7、2+的作用与生物素相似。 2. 利用膜缺损突变株 油酸缺陷型、甘油缺陷型 如:用谷氨酸生产菌的油酸缺陷型，培养过程中，有限制地添加油酸，合成有缺损的膜，使细胞膜发生渗漏而提高谷氨酸产量。 甘油缺陷型菌株的细胞膜中磷脂含量比野生型菌株低，易造成谷氨酸大量渗漏。应用甘油缺陷型菌株，就是在生物素或油酸过量的情况下，也可以获得大量谷氨酸。,7.增加有关基因的数量,增加结构基因或操纵基因的数量 例如，半乳糖苷酶、青霉素酶、氯霉素转酰氨酶等可借助含有相应结构基因的质粒转移给受体培养物来增加产量；利用含有对苯丙氨酸的结构基因的转导噬菌体可使该酶产量增加15倍。 通过操作基因与传统诱变技术和代谢调控相结合提高

8、产量。,启动基因的突变增加RNA聚合酶和DNA的亲和力，增加转录速率。,（二）发酵条件的控制,D A B C E F,(-),(-),(-),1.添加前体绕过反馈控制点,2. 添加诱导剂：从提高诱导酶合成量来说，最好的诱导剂往往不是该酶的底物，而是底物的衍生物。 如：大肠杆菌-半乳糖苷酶的最有效诱导剂是异丙酰-D-硫代半乳糖苷，它不被-半乳糖苷酶分解。 高浓度底物诱导剂的利用速率太快时，也会引起分解代谢物的阻遏，对许多发酵生产胞外酶，如果底物浓度过高，产量反而不高。 有些底物类似物作为诱导剂，因为利用速度慢，可以消除代谢物的阻遏，显著提高酶的产量。,3. 发酵与分离过程耦合：,在发酵过程中及时将末端代谢产物移走，末端代谢产物保持较低水平，解除反馈调节。 耦合手段较多，有膜分离、离子交换分离和萃取等。这些分离装置应该具有分离效率高、抗污染、易于重复使用等特定。,4. 控制发酵的培养基成分：,通过各种加料方法来限制生长速率，使酶生产去阻遏。 通过控制生物素来增加谷氨酸产生菌细胞膜的通透性；添加青霉素抑制细胞壁后期合成，细胞壁不能形成完整的网状结构，引起磷脂和细胞壁成分的UDP-N-乙酰己糖向外分泌使细菌