高效液相色谱法教学课件

1、高速液相色谱法highperformanceliquidchromatography (HPLC )，1，PPT学习交流，序言：HPLC是70年代以来发展最快的分析化学分支，目前已成为生化、医学、药物，2，PPT学习交流，中国：乃至少数的研究室广泛应用于质量管理、分析检验、制造分离。 讲义目的：入门教材：实用色谱分析法(二烯烃益兴编辑)学习要求：记笔记，以课程内容为主。3、PPT学习交流、授课时间安排：第一章：高速液相色谱法的基本原理4学时第二章：高速液相色谱法的仪器装置2学时第三章：液固， 结合相色谱分析法3学时第4章：离子交换色谱和络离子对色谱分析法3学时第5章：凝胶渗透色谱分析法1学时第

2、6章：实验技术和辅助实验技术1学时1学时复习工具书：1 .色谱格拉夫理论基础(放大镜章，戴朝政编)2.高效液相色谱(邹汉法，张玉奎， 放大镜章编萩)3.高速液相色谱法方法与应用(色谱分析法技术丛书、化学工业出版社、于世林编萩)，分离技术；混合物分离过程：样品中的各成分在固液两相间不断进行分配。 一相不固定，称为固定相。 另一个相是携带试料混合物流到固定相中的液体，被称为流动相。 第一章高速液相色谱法的基本原理，6，PPT学习交流，液质联用，7，PPT学习交流，高速液相色谱法的程序流程图，8，PPT学习交流，二，色谱分析法的原理，混合物中的各成分在相互不溶的两相中存在溶解、吸附等化学性能的两相相

3、对运动时，各成分在两相中反复进行多次平衡分配而相互分离。 9、PPT学习交流、分离原理：分离是物理过程。 固定相位移动相位注射洗脱交互，10 .通常为150300kgcm2且甚至700kgcm2或更多。 11、PPT学习交流，快速：分析时间比经典液质联用少得多(交换速度快)，复杂的样本分析只需要几分钟到几一盏茶。 高效：气体色谱法的分离性能高，高效液相色谱分析法的柱效应更高(化学键合相)，一般达到约6000理论棚米，12，PPT学习交流，高灵敏度紫外检测器的最小检测量达到(10-9 g )。 荧光检测器的灵敏度将达到(10-11g )。 所需样品较少，微升级的高选择性可以将不同种类的化合物和同

4、分异构体分离，可以分析性质上极为类似的化合物(同位素、同分异构体、空间同分异构体、手性化合物)、13、PPT学习交流、高速液相色谱法特性：高压、高效、高速、高灵敏度。 适用：高沸点，热不稳定样品，14，PPT学习交流，四，HPLC与GC的区别，1分析对象的区别GC :适用于气化、热安定性好、沸点低的样品，20% HPLC :溶解后溶液中可形成样品有机物的80%，15，PPT学习交流HPLC :流动相为液体，流动相与成分之间有相互作用力，参与影响色谱分析法分离。3操作条件差GC :加温操作HPLC :室温； 高压说明：气相、液相地位也同样重要的两个互补不足的色谱分析法方法灵敏度：气相液相应用范围

5、：液相气相、16、PPT学习交流、5、根据色谱分析法的分类吸附色谱法成分对固定相表面的吸附力的不同， 分离分配色谱(Partition Chromatography )成分在固定相和流动相中的溶解度不同，称为离子交换色谱(Ion Exchange Chromatography ) 分离的成分络离子交换亲和力不同引起的分离体积排除吉卜赛人格拉夫(Size Exclusion Chromatography )成分分子量不同、对固定相的渗透力不同引起的分离、17、PPT学习交流、基本概念1、色谱图、记录在案的浓度对分离时间的函数称为色谱图。18、PPT学习交流、时钟格拉夫过程的特点：当浓度对分离时间

6、呈高斯曲线型时钟格拉夫条件时，各成分均有特定时间出现在图像上，被称为成分保留时间。 在列效应的时间节点中，分量保持值越小，峰值越窄，保持值越大，峰值越宽。 相邻峰值的保持时间差越大越容易分离。19、PPT学习交流、二、色谱分析法残奥计、1 .保持时间tR用tR表示从试料注入开始到柱后出现试料的浓度极大值所需的时间。 学习20、PPT为交流、2 .分配系数k，将一定温度下成分在两相间达到平衡时的浓度比(单位： g/mL )称为分配系数k，分配系数是色谱分析法分离的依据。 k的值小，首先流出柱子k的值大，保留作用强，柱子出来。 21、PPT学习交流、分配系数k的研究、在一定温度下，成分分配系数k越

7、大峰值越慢的各成分的各固定相中的分配系数k选择不同的适当的固定相，则分离效果得到改善。各成分中有不同的k值是分离的基础(差移动速度)某成分的K=0时，即不残留在固定相中、22、PPT学习交流、3 .容量因子k (capacity factor )、在一定温度下，成分在两相间达到平衡时的质量比。 1.k都是与成分和固定相的热力学性质相关的常数，根据分离柱温度、柱压的变化而变化的2 .电容因子可以进行实验测量。 3 .色谱分析法保留作用：成分理化性质不同两相间分配量不同柱内保留时间不同，23，PPT学习交流，4 .容量因子与保留时间的关系，k太小-不能将填充剂用于一盏茶的分离能力k太大-分析时间过

8、长k范围： k1/0，25，PPT学习交流，库吉卜赛人格拉夫库特格拉夫分离过程的热力学和动力学问题。 成分保持时间为什么不同？ 库特格拉夫峰为什么变宽了？ 成分保留时间：色谱分析法过程的热力学要素控制(成分和固定相的构造和性质)色谱分析法峰变宽：色谱分析法过程的动力学要素控制(二相中的运动阻力、扩散)塔板理论和速率理论两种库特吉卜赛人格拉夫理论。26、PPT学习交流、1-3柱的分离效率、梯度理论、梯度理论认为：根柱子可分为n段，各段内的成分在两相间迅速达到平衡，各段称为一个理论梯度。 设柱长为l，理论架子高度为h，则H=L/为理论架子数。27、PPT学习交流、理论塔板数一n -吉卜赛人格拉夫峰

9、值对称：说明： a .在某个操作条件下，n大致相同的b. N是常数，tw是与按tR成比例变化的c .纵列长度有关的：在比较不同长度的纵列的纵列效果时，它们应该处于相同纵列长度之下示例d .为理想状态，28，PPT学习交流，如果存在拖尾峰值，则：可在堆半峰宽中表示N: N554 (tR/W1/2 ) 2 W1/2 -半峰宽，示例29，PPT学习交流，理论架高h， 物理意义：分量在两相间达到一次平衡的对应柱长h -愈伤组分，二相间平衡分配次数越多越有效(不能说分离是一定实现的)，30，PPT学习交流，说明：大，固定相分离潜力大。 在一定的色谱条件(分离的有无也取决于其他的色谱条件)下，k越有差异的

10、成分，柱效果越高，分离效果越好。31、PPT学习交流、搁板理论的特征和不足： (1)l为一定时，n越大(h越小)，被测定成分在柱内分配的次数越多，柱效果越高，得到的色谱分析法峰越窄。 (2)柱效应不能表示分离成分的实际分离效果：如果2成分的分配系数k相同，则无论该柱的柱效应如何大也不能分离。32、PPT学习交流、(3)梯级理论不能说明同一柱在不同流动相流速下柱效应不同的实验结果，也不能指出影响柱效应的因素以及提高柱效应的途径。 33、PPT学习交流、2 .峰值扩散和速度方程、1 .峰值扩散-由于列内列外的各种因素导致的时钟格拉夫峰值的扩散和变形，列效应降低峰值扩散的程度：列内的成分的平衡分配次

11、数示例：引起峰值扩散的因素：列内、列内a、b、c三个要素分别与什么样的要素相关联？ 35，PPT学习交流，a涡扩散项，A=2dp dp :固定相的平均粒径：固定相的填充不均匀因子，固定相粒子越小dp填充越均匀，a、h、柱效应。 减轻了涡流扩散引起的色谱峰变宽的现象，显示出色谱峰变窄。 36、PPT学习交流、B/u分子扩散项、B=2 D D :试料成分分子的扩散系数(cm2s-1) (1)存在浓度差，产生纵向扩散。 (2)由于扩散，色谱分析法的峰值变宽，h ()，分离变差(3) B/u与流速有关：流速滞留时间扩散(0.5ml/min) (4)扩散系数d，b值。 液相中，分子扩散可忽略，37，PP

12、T学交流，C u传质项，传质分子在两相间浓度不同，从浓度高的相向浓度低的相不断移动，直到浓度达到平衡。 根据传递形态：固定传递质量转移C=(Cs Cm )，38，PPT学习交流，固定传递物质原因：向固定相的进出速度不同(固相，液相)减少措施：薄的固定相层小粒子填充剂移动传递物质原因：移动滞留减少措施填充均匀地使用小粒子填充剂和表面多孔质(2)选择适当的固定相粒度、液膜厚度和流动相流速为40、PPT学习交流、(3)色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。 明确了流速和填充剂对色谱柱效果和分离的影响。 要使柱的效果最大化，请选择最佳条件。 41、PPT学习交流，4 .获得高柱效应的一些方法：细颗粒填

13、料流动相流速低流动相黏性系数小上升温度溶质扩散系数及其结构关系大分子、扩散系数小分子、扩散系数大、42、PPT学习交流，5 .影响分离的因素和提高柱效应的途径液体的扩散系数只有气体气相和液相的区别，43，PPT学习交流，分离度(Rs )，色谱分析法分离目的：-合理时间内成功分离样品中成分的程度：表示分离情况的一种分离度影响因素：保留值差色谱分析法过程热力学因子峰幅度色谱分析法过程的动力学因素。 44、PPT学习交流、探讨：色谱分析法分离4种情况：柱效高、k (分配系数)大、完全分离。 k不太大，柱子效果好，峰值狭窄，基本分离。 柱子效果低，k大，但分离差。 k小，柱效应低，分离效果更差。 45

14、，PPT学习交流，46，PPT学习交流，一个分离度的公式：R=0.8 :两个峰的分离度为89%； R=1:分离程度98% (达到定性量化分析的最低要求) r=1.5:99.7% (相邻的2个峰达到基线分离)。 47、PPT学习交流，对于浓度不同的成分来说：两种成分的分离度随浓度比的增大而减少的例子：对于多成分来说：整个色谱分析法的分离度依赖于Rs最小值的两个峰。 48、PPT学习交流、二分离度影响因子峰的宽度(峰宽度越小，Rs越大)峰的宽度狭窄主要反映了吉卜赛人格拉夫分离的动力学特性两峰的保持时间之差(tR越大，Rs越大)。 吉卜赛人格拉夫分离热力学特性分离度基本关系式：49，通过改变PPT学

15、习交流k调整溶剂的强度，可以增大k- -使用弱溶剂降低-使用强溶剂的正相色谱分析法-固定相极性大于流动相(溶剂极性大，溶剂强度大，溶出能力小) 反相色谱-固定相极性比流动相小(溶剂极性大，溶剂强度小，溶出能力小) p307311例：流动相极性变化对成分k的影响，51，PPT学习交流，交换柱(变更n )，对策： a .长的柱(N=L/H ) 填充剂粒子尽可能小的c .低流速(溶质的传递阻力小、峰值扩大的a .流动相梯度溶出过程中，根据流动相组成的经时变化而变化的P279 (适用于极性范围宽的样品) b .固定相(柱交换、填充剂变更) c .温度(热力学参数变更)、5 5开始k已经在1 k 10的范围内，但是如果Rs不大，应该增大n以改进Rs。 当k，n的变化不能使Rs增大时，在变化上下功夫，54，PPT学习交流，第二章仪器设备四个零配件：高压输液泵进样器高效分离柱检测器，55，PPT学习交流