兽医学畜牧学-遗传的物质基础.ppt

1、第三章 遗传的物质基础,第一节 遗传物质的本质,一、DNA是遗传物质 （一）DNA是遗传物质的证明 1928年Griffith等进行的肺炎球菌转化（transformation ）实验. 1944年Avery证明DNA是遗传物质.,（二）DNA携带两类不同的遗传信息 1.负责基因结构的信息 2.负责基因选择性表达的信息,二、RNA也可作为遗传物质 （一）RNA病毒 病毒颗粒（viron）：由病毒RNA基 因组和包被在外的蛋白质外壳组成. 病毒的生存方式：病毒编码包装基因 组所需的蛋白，以及一些在感染循环 中复制病毒所需的蛋白质。其他蛋白 质由宿主提供。因此病毒不能独立生 存。,（二）类病毒（v

2、iroid） 类病毒: 是使高等植物产生疾病的有传染 性的因子，由很小的环状RNA分子构成。 与病毒不同，类病毒的RNA本身就是感染 因子。类病毒只由RNA组成，其中广泛 存在不完全的碱基配对，形成一种特有 的棒状结构。类病毒的基因组不能编码 蛋白质。,类病毒的复制：必须由宿主的酶来完成，其RNA作为模板。 类病毒对宿主的影响：类病毒可通过复制占有宿主细胞中关键的酶，从而影响宿主细胞的正常功能；类病毒也能影响必需的RNA的产生而引发疾病；它们还可以作为一个不正常的调控分子，对个别基因的表达产生特殊的影响。,三、是否存在核酸之外的遗传物质？ （一）朊病毒（prion）： 是一个28KDa的疏水性

3、糖蛋白，由细胞 的核基因编码，在正常动物的脑组织中 有表达。 （二）朊病毒的存在形式： 朊病毒以感染性形式（PrPSC)，和非感染性形式（PrPC）两种形式存在。,（三）两种形式的朊病毒的异同： PrPC PrPSC 功能 ： 不详 导致退行性神经疾病 分 布： 正常脑 被感染脑 抗蛋白酶性： 可被完全降解 只能被部分降解 溶解性： 可溶 难溶 一级结构： 两者相同 二级结构： 40%-螺旋 20% -螺旋， 50%-折叠,（四）朊病毒的感染方式 PrPSC 作用需要PrPC 的参与 PrPSC 蛋白的错误折叠形式可以催化天然PrPC分子从正常的可溶性的螺旋构象向不溶性的-折叠构象转化，最终导

4、致了疾病和感染。,（五）朊病毒的多株现象 不同PrPSC株可使一种PrP结构转化为不同的构型；而同一种PrPSC可以在具有不同PrP蛋白的多种生物中传代，即使经过多次传代仍然保持自身的生物学特征。 （六）朊病毒是遗传物质吗？ 多株现象难以解释 其感染方式能否被视为遗传复制？,第二节 DNA的一级结构,一、DNA一级结构的组成 一级结构： 4种脱氧核苷酸的连接及其排列顺序。 (一）含氮碱基（nitrogenous bases）,胞嘧啶（cytosine, C）、 胸腺嘧啶（thymine, T）、 腺嘌呤（adenine, A）、 鸟嘌呤（guanine, G）,DNA中的常见碱基有： 胞嘧啶（

5、cytosine, C）、胸腺嘧啶（thymine, T）、 腺嘌呤（adenine, A）和鸟嘌呤（guanine, G）,(二）戊糖：核糖和脱氧核糖,（三）脱氧核糖核苷（nucleoside） 由碱基和戊糖（D-脱氧核糖）缩合而成。 有4种脱氧核糖核苷：胞嘧啶脱氧核糖核苷、 胸腺嘧啶脱氧核糖核苷、腺嘌呤脱氧核糖核 苷和鸟嘌呤脱氧核糖核苷。,+,+,H2O,H,（四）脱氧核糖核苷酸 脱氧核糖核苷和磷酸缩合形成的磷酸酯,（五）脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid, DNA） 脱氧核糖核苷酸以3，5磷酸二酯键聚合成为 脱氧核糖核酸（DNA）链。链的一端的核苷酸有自 由的5磷酸

6、基团，称5端；另一端核苷酸具有自由 的3羟基，称3端。,一个脱氧核苷酸的3端与下一个的5端通过磷酸二酯键连接。,DNA链的方向就是从5端 到3端。 DNA分子通常以线性或环 状的形式存在。大多数 DNA由两条互补的单链构 成。少数生物的DNA，如 某些噬菌体或病毒是以 单链形式存在的。,二、序列测定方法 （一）小片段重叠法 （二）凝胶直读法 1.酶法 （1）加减法（Sanger,1975） （2）末端终止法(双脱氧法/间接拷贝法)（Sanger,1977） 2.化学法（Maxam/Gilbert,1977） 适用于DNA短片段的测定,末端终止法的应用循环测序（cycle sequecing)实

7、验及原理 a.测序反应的设定 体系中包括：DNA模板，TaqDNA聚合酶，寡核苷酸引物，4种dNTP 和荧光ddNTP（4种荧光）等 b.反应 包括：DNA变性，引物与模板配对，DNA聚合酶使引物延伸（在引物3末端接上dNTP或ddNTP）； c.反应的终止 20-30个循环后，新合成所有可能的DNA片段，每个片段的3末端都被接上ddNTP，延伸终止； d.反应产物电泳分离及检测 在聚丙烯凝胶中，不同大小的DNA片段在高压电场作用下迁移，小分子迁移速度快，先被位于凝胶底部的装置检测到。 e.结果的处理及输出 根据被检测到的DNA片段的顺序及颜色，绘出DNA片段的电泳图谱。DNA序列中的每个核苷

8、酸由一系列按顺序排列的彩色峰型显示出来,双脱氧核苷三磷酸,ddATP,ddGTP,ddTTP,ddCTP,GTATGCTAGCAT,三、一级结构的重要性 携带遗传信息 决定DNA的二级结构 决定DNA的空间结构,第三节 DNA的二级结构,一、DNA螺旋的几种构象及其动态平衡 （一）Watson Crick右手双螺旋结构 （B-DNA构象） 相对湿度为92%时， DNA钠盐纤维为B-DNA构象。 在天然情况下， 绝大多数DNA以B构象存在。,a.反平行双链右手螺旋 b.糖Pi在螺旋线上 c.碱基伸向内部其平面垂直于轴 d.A=T、G=C e.直径=2nm，一圈上升10对核苷酸，螺距为3.4nm

9、f.大沟（major groove）、小沟（minor groove）,WatsonCrick双螺旋结构模型特点：,（二）A-DNA构象 为相对湿度改变（75%以下）或由钠盐变为钾盐、铯盐，DNA的结构可成为A构象。它是B-DNA螺旋拧得更紧的状态。DNA-RNA杂交分子、RNA-RNA双链分子均采取A构象。,（三）Z-DNA构象 在一定的条件下（如高盐浓度），DNA可能出现Z构象。Z-DNA是左手双螺旋，磷酸核糖骨架呈Z字性走向。不存在大沟，小沟窄而深，并具有更多的负电荷密度。,A-型 B-型 Z-型,A-DNA、B-DNA和Z-DNA的一些结构特征,B-DNA是活性最高的DNA构象，B-D

10、NA变成A-DNA后，仍有活性，但若局部变构为Z-DNA后，活性明显降低。,二、决定双螺旋结构状态的因素 （一）氢键 1.碱基的氢供体 氨基、羟基 2.碱基的氢受体 酮基、亚氨基 3.G-C对及A-T对 之间的氢键: （在一定范围内DNA的稳定性与G-C百分含量成正比）,（二）碱基堆积力 1，碱基堆积力 同一条链中的相邻碱基之间的非特异性作用力 2，碱基堆积力的来源 疏水作用力 累积的Van der Waal的作用力 3，碱基堆积作用的证据 单链多核苷酸倾向于碱基平行排列的规则螺线结构 破坏疏水作用和双链的氢键可降低DNA的稳定性,Pu的双环结构，其长度接近或超过螺旋轴心 每对Bp又以prop

11、eller twist 形式存在,（三）带电荷的磷酸基的静电斥力 磷酸集团的负电对DNA双链的稳定性起负作用。阳离子可对之产生屏蔽。DNA溶液的离子浓度越低，DNA越不稳定。 （四）碱基分子内能 碱基内能越高，氢键和碱基堆积力越容易被破坏，DNA双链越不稳定,第四节 DNA的三级结构,形成超螺旋的原因和条件： 原因：因某种原因引入了额外的螺旋。 条件：a, DNA双螺旋闭合或被蛋白结合，末端不能自由转动； b, DNA双链上无断裂。,一、超螺旋结构 DNA的三级结构是指DNA双螺旋的进一步扭曲盘绕所形成的构象，主要表现为超螺旋结构。,松弛态（relaxed state）: DNA中心轴与平面平

12、行即不扭曲的状态。,超螺旋：双螺旋结构的DNA再次扭曲形成的螺旋结构。 a .右旋超螺旋 负超螺旋（Negative supercoil） b.左旋超螺旋 正超螺旋（positive supercoil）,环状DNA分子的拓扑学性质 L=T+W W=L-T L：连环数（ Linking number）指一个封闭环状DNA双螺旋分子中的两条链彼此盘绕的次数； T：双螺旋中转数（Twisting number，也叫螺圈数）是双螺旋本身所有的性质。其数量等于碱基对总数除以每一圈的碱基对数（如：520010.4=500）； W：超螺旋数（Writhing number）。 DNA的拓扑异构体： 松弛型

13、：W=0，L=T； 负超螺旋：LT,例：动物病毒SV40的DNA（环状，含5200bp）， 在无超螺旋时， L=500， T=500，W=0； 但实际上从细胞中分离出的SV40DNA含有25个负 超螺旋，所以它的L=475，因此， L对一个DNA分子 来讲是一个拓扑学特性，在不发生链的断裂时 它是一个常数。（475=500-25）,L=T+W W=L-T,比连环差（Specific linking difference)（以 表示） 用来表示超螺旋的程度；当初级螺旋 数不变时， 代表超螺旋密度。 公式： =（L-L0）/ L0 （L0：表示松弛环型DNA的连环数） 如一超螺旋DNA的L =23

14、，L0 =25， 则 =-0.08，大多数天然存在的DNA 分子超螺旋密度在-0.03-0.09之间。,超螺旋结构存在的意义 密度大，体积小，在细胞中 所占体积较为经济； 超螺旋结构能影响双螺旋的 解链程度，因而影响DNA分 子与其它分子，如酶、蛋白 质等分子的相互作用，参与 DNA复制、重组、转录等重 要功能。 DNA的拓扑异构体可用凝胶 电泳分开。,影响DNA高级结构的酶 L值的改变需要至少一条DNA链断裂一次。断裂造成的DNA自由末段的一断可绕着另一端旋转，随后被重新连接，DNA拓扑异构酶通过催化此类反应将DNA从一种拓扑结构转变成另一种。,l 拓扑异构酶 (topoisomerase

15、I, II) 参与构型的改变,Top I 对负超螺旋处的单链DNA具有极强的亲合力,Top II,1. I型DNA拓扑异构酶 底物： DNA单链 ATP： 不需 酶活性：DNA内切酶和连接酶活性 代表： E.Coli的DNA拓扑异构酶I： 可催化负超螺旋DNA转化为 松弛环型。 鼠DNA拓扑异构酶I：对正、 负超螺旋有相同的松弛能力。,原理： E.coli拓扑异构酶识别部分解螺旋的DNA分子，与DNA单链部分结合后，切断一条链，并以其酪氨酸残基与DNA的5磷酸相连。磷酸二酯键从DNA转移蛋白质上。酶将完整的DNA链拉过缺口后（ L =+1），重新连接原先单链上磷酸二酯键。,上述过程除了改变DN

16、A的超螺旋结构外，还可使单链环状分子形成三叶结构，以及使两个单链环状分子成为环连体分子。,2. II型DNA拓扑异构酶 底物 DNA双链 ATP 需要 酶活性 DNA内切酶和连接酶活性 代表 E.Coli旋转酶（DNA拓扑异构酶II），可引入负超螺旋。无ATP时，此酶只能缓慢地松弛负超螺旋。,E.Coli的旋转酶还具有形成和拆开双链DNA环连体和成结分子的能力。 此类酶无碱基序列特异性。,3. DNA拓扑异构酶催化反应的实质： 其本质是先切断DNA的磷酸二酯键，改变DNA的链环数后再连接，兼具DNA内切酶和DNA连接酶的功能。然而这些酶并不能连接事先已经存在的断裂DNA，即其断裂及连接反应是相

17、互偶联的。,二、生物体内的超螺旋,1.环状DNA的超螺旋 生物体如某些小病毒、细菌质粒、真核线粒体、叶绿体、噬菌体PM2、以及某些细菌的DNA为双链环状，在细胞内进一步扭曲形成超螺旋的三级结构。,2.染色体DNA的三级结构 为DNA双螺旋盘绕在组蛋白上的超螺旋结构。,H1,H2A、H2B、H3、H4各2分子组成聚合体,H1结合在核小体间的DNA上,三、三股螺旋DNA (Trible Helix DNA, T.S DNA), T.S DNA 的发现与证实,l 1953 年以前Pauling (Chemist) 提出 T.S DNA 存在的可能性,l 1953 年 Watson & Crick D

18、.S DNA model 证明沿大沟存在多余的氢键给体与受体,潜在的专一与DNA (蛋白质)结合的能力,形成T.S DNA 可能性,l 1957年Davis , Felsenfeld , Rich 发现,T.S DNA的概念,l 1966年Miller & Sobell,实现 RNA + D.S DNA,Trible polyNt,as Repressor 关闭基因,但由于D.S DNA的提出而被忽视,但因证明 LacI 产物为 Repressor 而被忽视, 1975年 Perlgut 人工 合成T.S DNA并证明其 Tm 值, 沉降系数(S),l 1987 年 Mirkin . S .

19、M Nature 330 (495) 证明plasmid DNA 在 pH= 4.3的溶液中, 有T.S DNA的存在, 1987年 Dervan . Moser Science 238 (645) 合成S.S DNA + D.S DNA T.S DNA,实现DNA的定点切割 研究X-ray photograph 核磁共振 结构功能,继Davis（1957）后 30年 第一次证明T.S DNA 在生物体内的存在, T.S. DNA的类型, 1. D.S. DNA + D.S.DNA,T.S. DNA + S.S. DNA,Homologous palindromic sequence in a

20、 D. S. DNA Nodule DNA or Hinged DNA,l2. S. S. DNA + D. S. DNA T. S. DNA PU + PU/PY (偏碱性介质中稳定) PY + PU/PY (偏酸性介质中稳定) 常见类型,第三条链位于B-DNA的 Major groove中 与D. S. DNA一起旋转,T. S. DNA 的连接键,Watson bonding A T G C (D. S. DNA),H+,Hoogsteen bonding G C+ (pH 小于7) 第三链 质子化 第二链的pu 6,7与第三链的碱基形成 H 键,三股螺旋DNA形成的条件及结构特点,第三

21、条单链DNA分子 位于B-DNA大沟内,与B-DNA以 Hoogsteen 键连接,T. S. DNA可能的功能,a) T. S. DNA可阻止调节蛋白与 DNA结合, 关闭基因转录过程,b) T. S. DNA 与基因重组, 交换有关,加入第三条S. S. DNA 作为分子剪刀(molecular scissors), 定点切割DNA分子,d) 加入反义的第三条链(anti-sence polydNt) 终止基因的表达,四、四股螺旋DNA ( tetraplex DNA, Tetrable Helix DNA ),发现,均有形成 四股螺旋DNA 的可能,结 构 特 点,Linked by H

22、oogsteen Bonding,2 poly(T4G4) 2 poly(G4C4),结 构 特 点,GGGGTTTGGGGTTTGGGGTTT,真核生物染色体端粒DNA结构,可能的功能,A 稳定真核生物染色体结构,B 保证DNA末端准确复制,C 与DNA分子的组装有关,D 与染色体的meiosis & mitosis 有关,第五节 DNA的变性、复性、杂交和Cot曲线,一、DNA的变性 DNA变性（熔解）：DNA被加热或某些试剂的作用下，配对碱基之间氢键和相邻碱基之间的堆积力受到破坏，逐步变为近似于无规则的线团构像的过程。 （一）单、双链DNA的紫外光吸收 双链DNA：A260=1.0时，

23、50g/ml 单链DNA：A260=1.0时， 33g/ml （单链RNA：A260=1.0时，40g/ml）, D.S. DNA,S.S. DNA,( 加温, 极端pH, 尿素, 酰胺 ),（二）DNA的熔解曲线 Tm值：缓慢而均匀地升高DNA溶液的温度，当A260增加到最大增值的一半时的温度，叫做DNA的熔解温度 （Melting temperature）或熔点，用Tm表示。（一般在70-85） DNA变性不仅受外部各种因素的影响，而且取决于DNA分子本身的稳定性，即Tm值直接与DNA的性质相关。,1.185,= OD增加值的中点温度(一般为85-95),不同DNA的Tm值对G-C含量作图

24、能得到一条直线，因此测定Tm值可以推算出DNA碱基分子组成。,（三） 影响 Tm值的因素, 在 A, T, C, G 随机分布的情况下, GC%含量相同的情况下,GC%愈高 Tm值愈大,GC%愈低 Tm 值愈小,AT形成变性核心，变性加快，Tm 值小,碱基排列对Tm值具有明显影响（除变性核心外） （碱基堆积力的差异 ）, 大片段D.S. DNA分子之间比较,片段长短对Tm值的影响较小, 与组成和排列相关, 小于100bp 的 D.S DNA分子比较,片段愈短， 变性愈快，Tm值愈小, 变性液中含有尿素，酰胺等, 盐浓度的影响,单链DNA主链的磷酸基团,负电荷的静电斥力,两条单链DNA的分离,N

25、a+在磷酸基团周围形成的电子云 对静电斥力产生屏蔽作用,减弱静电斥力,Tm ,Tm ,二、复性 DNA复性：变性DNA在一定条件下恢复天然DNA结构的过程。 （一）复性的条件 1，消除磷酸基的静电斥力； 2，破坏连内氢键 （二）复性的机制 1，随机碰撞 取决于DNA浓度、溶液温度、离子强度等 2，成核作用（nucleation) 3，拉拉链作用（zippering）,3-ATCTATGCTGTCAT-5,5-TAGATACGACAGTA-3,5-TAGATACGACAGTA-3,3-ATCTATGCTGTCAT-5,3-ATATATATATAT-5,5-TATATATATATA-3,3-ATA

26、TATATATAT-5,5-TATATATATATA-3,5-TATATATATATA-3,3-ATATATATATAT-5,3-ATATATATATAT-5,5-TATATATATATA-3,影响DNA复性过程的因素 ：,影响DNA复性过程的因素 ：,DNA 分子中, dNt 的排列状况 (随机排列, 重复排列),S.S, DNA 的初始浓度 C0,三、Cot曲线 在一定条件，复性速度变化可用Cot值衡量。Co表示变性DNA的最初浓度（bp，mol/L）， T为复性时间（s），即Cot值为变性DNA的 最初浓度与复性时间的乘积（mols/L）。 病毒和原核生物基因组的Cot曲线是单一的s形曲

27、线，真核生物基因组的Cot曲线是多s形Cot曲线，重复频率高的序列复性速度快， 重复频率低的则慢。,不同物种核酸的Cot曲线,原核生物DNA的复性动力学,原核生物Cot曲线形状： 不同生物曲线形状相似，都是单一的S形；原核生物Cot曲线： 跨度一般只有两个数量级； 原核生物Cot曲线位置： 基因组越大越靠右。,Cot（mols/L）,真核生物Cot曲线 特点： 阶梯状，跨度7-8个数量级。 真核生物Cot曲线的 组成： 快复性组分/中间复性组分/慢复性组分。,真核生物DNA复性动力学,E.Coli DNA,Ct/C0,C0 t,0.03,6,3000,40%,60%,Calf thymus D

28、NA,1,0,四、杂交 重要的杂交技术： Southern Blotting Northern Blotting,一、RNA的结构特征 RNA的碱基组成与一级结构 （1）碱基组成：A、G、C、U （2）一级结构：基本组成单位核苷酸（AMP、GMP、CMP、UMP） 核苷酸间的连接键35 磷酸二酯键 存在状态 单链、只有少数为双链（暗色蛾 CPVRNA 5150 bp ）,第六节 RNA的结构,双螺旋、内部环、 单碱基、突起和突环、 发夹环、多分支环或 结合环、假结、 单链区,二、RNA二级结构元件：,三、mRNA结构1. 原核生物mRNA 为多顺反子mRNA（polycistron），即一条mRNA可编码几条肽链。无帽子结构和尾巴，不含稀有碱基，半寿期为13min，二级结构有丰富的自身回折产生的双链区.,2. 真核生物mRNA 为单顺反子mRNA（monocistron），即一条mRNA只编码一条肽链。 5 有帽子结构，3 有尾巴，含少量稀有碱基，半寿 期可达1小时。,四、 rRNA的结构rRNA 形成大量的双螺旋、突环、结合环等,E.coli 5S rRNA二级结构,E.coli 16S rRNA二级结构,1.一级结构 （1）分子量25000左右；7399个核苷