第六讲-基因克隆的质粒载体

1、第六讲基因克隆的质粒载体吴乃虎遗传和发育生物学研究所2005年8月基因克隆的质粒载体一.导言1.质粒是一种显著的亚细胞生物它的结构比病毒简单。它既没有蛋白质外壳，也没有细胞外生命周期。它只能在宿主细胞中增殖，并随着宿主细胞的分裂而遗传。2.质粒有多种类型F-质粒：F-因子或性别质粒，它能把宿主染色体上的基因和F-因子一起转移到宿主受体细胞中，而在此之前质粒是不存在的。R质粒：被称为抗性因子，R因子)，它编码一个或几个抗生素抗性基因，并且可以将这种抗性转移到缺少该质粒的合适的受体细胞。Col质粒：所谓的Col质粒，是一种产生大肠杆菌素的因子，编码一种控制大肠杆菌素合成的基因。大肠杆菌可以杀死没有

2、Col质粒的密切相关的细菌菌株。3.质粒载体20世纪70年代实验室构建的最广泛使用的基因克隆载体之一。二、质粒的一般特征1.质粒脱氧核糖核酸(细菌质粒的定义)*1 .大肠杆菌的质粒是一种共价闭合的环状DNA (cccdna)，它独立于宿主染色体进行复制。除了酵母的黑仔质粒是核糖核酸质粒外，其他质粒都是质粒。然而，质粒DNA的复制必须依赖于宿主提供的核酸酶和蛋白质。*2 .质粒的分子大小文献中有三种说法：小的只有103KD，只能编码2-3个蛋白质；大的可以达到105千道尔顿，两者相差几百倍。1Kb200Kb (Sambrok等人)5Kb400Kb(莱宁格尔)MD(兆道尔顿)=106D(兆道尔顿)

3、1.5Kb1MD*3 .质粒DNA与宿主染色体DNA的关系一般来说，质粒DNA可以在宿主染色体外保持自由状态，但在某些条件下，它可以可逆地整合到宿主染色体中，然后复制和细胞分裂成后代。*4 .质粒DNA的分子构型超螺旋构型：也就是说，由共价闭合的环状cccDNA呈现的超螺旋构型。走在凝胶前面。环状构型：即开环的脱氧核糖核酸构型，其中一条脱氧核糖核酸链保持完整的环状结构，而另一条链有一到几个间隙。走进凝胶的最后一格。l构型：由双链断裂形成的线性DNA分子的构型，称为l型。走在凝胶中间。2.质粒克隆载体的必要条件(三个常见成分)(1)具有复制区域或复制因子(复制器)复制因子：它是指一种特定的质粒D

4、NA，它包含质粒DNA的ori(复制起点)，以及编码质粒DNA和质粒复制所需的DNA序列结构。*注意复制器和复制器之间的概念差异。复制子：指含有复制起始位点的DNA复制单位，如细菌染色体、病毒基因组、质粒基因组等。任何基因单位，只要它的脱氧核糖核酸能自动复制，就叫做复制子。*一般来说，质粒只包含一个复制起点，并构成一个独立的复制子。然而，在少数情况下，融合产生的质粒也含有两个复制子，但只有一个是活性的。抗生素抗性基因理想的质粒克隆载体应具有两种抗生素抗性基因，以便为宿主细胞提供易于检测的表型性状作为选择标记，并且通过将外源DNA片段插入相关的限制性酶识别位点而形成的重组质粒应至少保留一个强选择

5、标记。具有几个限制性酶的单一识别位点这种分子结构特征可以满足基因克隆的需要，插入适当大小的外源基因片段后，质粒的复制功能不会受到影响。分子量较小，拷贝数较高这种质粒的优点是：A.低分子量质粒易于操作，在克隆外源基因片段(一般不超过15Kb)后仍能有效地转化为受体细胞；B.较高的拷贝数有利于质粒DNA的制备，增加克隆DNA片段(基因)的产量；C.低分子量质粒分子中特定限制性酶的多个识别位点的概率将相应降低；3.质粒编码的表型质粒的分子量小，仅占细胞染色体的一小部分，一般约为3%。尽管质粒的分子量很小，但它编码重要的遗传性状：A.抗性特征：抗生素抗性、重金属抗性、毒性阴离子抗性和其他抗性。B.代谢

6、特征：抗生素和细菌素的合成；简单碳水化合物(如乳糖和蔗糖)的代谢；复合碳水化合物(甲苯、苯胺)和卤代化合物的代谢；蛋白质代谢；固体氮作用；H2S合成；柠檬酸的利用；欧文氏菌色素形成：产碱杆菌的反硝化活性。产碱杆菌合成硫胺素。和欧文氏菌。C.改变宿主生活方式的因素：大肠杆菌肠毒素的合成：金黄色葡萄球菌剥脱毒素的合成：炭疽杆菌外毒素的合成：苏云金杆菌l-内毒素的合成：破伤风杆菌神经毒素的合成：大肠杆菌定殖抗原的合成：大肠杆菌和链球菌溶血素的合成；肠道细菌的血清耐药性；耶尔森氏菌的毒性：炭疽杆菌荚膜的合成：铁在大肠杆菌中的转运。D.其他特征：芽孢杆菌细胞中气泡的形成；链霉菌的布莱恩形成(致死结)；肺

7、炎克雷伯菌Kik IncN质粒的致死效应；土壤杆菌对细菌素的敏感性；麻风杆菌半透明/不透明菌落的变异：Nod Flx豌豆根瘤菌的根际蛋白质合成；盲肠acter包涵体的生成；葡萄球菌的内肽酶活性。4.质粒的转移(1)接合质粒和非接合质粒*接合质粒：也称为自我转移质粒，带有自我复制基因。控制细菌配对和质粒接合转移的基因；*非接合质粒：也称为不能自我转移的质粒，它有一个自我复制的基因，但失去了控制细胞配对和接合转移的基因，因此它不能从一个细胞转移到另一个细胞。大肠杆菌素基因大肠杆菌Col质粒非共轭质粒具有抗生素抗性基因的大肠杆菌r质粒也称为r因子。带有宿主染色体DNAF因子结合质粒(因子)加大肠杆菌

8、素基因大肠杆菌素Col质粒添加抗生素抗性基因大肠杆菌重组质粒和重组因子结合质粒因子是最具代表性的结合质粒：f因子在宿主菌中的三种存在方式：A.染色体外双链环状DNA，f细胞B.染色体外双链环状脱氧核糖核酸细胞宿主染色体片段C.以线性DNA的形式整合到Hfr细胞中在宿主染色体上。接合质粒f因子的接合转移；F细胞和F细胞，以及有性须的毛状结构F细胞和F细胞共培养，这些细胞由性须配对。这个过程叫做细菌结合在细胞配对过程中，F细胞中的F因子遵循滚环复制模式，通过性须通道进入F细胞(单链)细胞变成细胞质粒的接合和转移以及基因工程的安全载体；从基因工程的安全性角度来看，我们主要对非共轭质粒感兴趣：原因如下

9、：(1)联合型不仅转移自身；也可引起宿主染色体片段的转移；如果F因子整合到宿主染色体中，会影响染色体的高频转移。(4)引起其他非共轭质粒的迁移。5.质粒DNA的动员(1)质粒DNA迁移的概念由共存的接合质粒引发的非接合质粒的转移过程称为质粒DNA的迁移。非接合质粒不能自我转移，因为它的分子量小到足以编码转移过程中所需的所有基因。然而，如果在宿主细胞中存在共存的接合质粒，它们通常可以被转移。质粒DNA迁移的原理ColE1质粒是一种迁移性非接合质粒ColE1质粒迁移的生化过程：迁移条件Bom位点，(位于ColE1质粒分子上)由mob基因编码的核酸酶也被称为迁移蛋白*1.bom位点也称为nic位点，

10、迁移蛋白作用于nic位点，从而诱导非连接质粒迁移。Mob基因=联合动员基因。Nic位点=当启动接合DNA转移时，自转移接合质粒在转移起点oriT受到链特异性和位点特异性单链切割的DNA位点。*2 .许多质粒载体在构建过程中丢失了nic位点，因此无法迁移。nic-质粒的转移途径是形成融合质粒，使它们成为形式上的接合质粒的一部分。*3 .重组缺陷宿主菌株的应用在有重组缺陷的宿主菌株中，nic质粒不会与接合质粒重组，因此nic质粒在recA宿主中比nic质粒更稳定。*4 .图4-5说明6.质粒DNA的复制类型低拷贝数质粒受“严格质粒”控制高拷贝数质粒的“松弛质粒”质粒拷贝数的定义：文献中常用两种定义

11、A.通用定义：当在标准培养基中生长时，每个细菌细胞中包含的质粒DNA分子的数量。B.特殊校准：在富培养基中快速生长的细菌细胞可以有3-4个染色体，而在碳供应不足的培养基中缓慢生长的细菌细胞平均只有1.1个染色体。因此，在一些文献中质粒拷贝数的定义是每个细菌细胞中每条染色体上质粒DNA分子的平均数。C.这本书定义了在LB液体培养基中生长的每个细胞含有20个以上的质粒，这被称为高拷贝数质粒；当拷贝数小于20时，称为低拷贝数质粒。7.质粒的不相容性不相容，即不相容定义：指在没有选择压力的情况下，两个密切相关的质粒不能在同一宿主细胞中稳定共存的现象。注意：只有当有明确的证据表明第二个B已经进入含有质粒

12、A的宿主细胞，并且其DNA没有被宿主细胞限制系统降解，但这两个细胞不能长时间共存时，只有在这种情况下我们才能说A和B是不相容的质粒。不相容组的概念：彼此不相容的质粒属于同一不相容组。可以相互共存的质粒属于不同的不相容组。同一个不相容群体的南方粒在遗传关系上是密切的。质粒不相容的分子基础质粒不相容的分子基础主要是由它们的复制功能之间的相互干扰引起的：*1负反馈环大多数质粒产生阻遏蛋白，阻遏蛋白可以控制质粒的复制，阻遏蛋白的数量与细胞中质粒的拷贝数成正比。当质粒的拷贝数较少时，细胞中的阻遏蛋白相对减少，因此阻遏蛋白与质粒DNA中的靶序列相互作用使其复制。随着质粒DNA的复制，质粒的拷贝数增加，因此

13、编码产生的阻遏蛋白数量增加。由于细胞中阻遏蛋白的浓度增加，将形成二聚体，从而失去与质粒结合并促进其复制的能力。结果质粒复制停止，即质粒拷贝数受被抑制蛋白的负反馈调节：负反馈控制回路(负反馈回路)当质粒面对高拷贝数和高浓度的阻遏蛋白时，其复制活性被抑制。当质粒的拷贝数低，阻遏蛋白浓度低时，其复制活性将继续。*2 .同一细胞含有两个相容的质粒因为这两个相容的质粒是远相关的，它们产生的阻遏蛋白不会影响另一个质粒的复制。因此，这两种相容的质粒在同一细胞中保持正常的拷贝数。*3 .同一细胞含有两个不相容的质粒鉴于这些不相容质粒之间的密切遗传关系，由它们产生的阻遏蛋白不仅影响它们自身质粒DNA的复制，还影

14、响彼此质粒DNA的复制。因此，两种阻遏蛋白共同调节质粒的复制速率。质粒拷贝数控制系统不能区分这两种不相容的质粒，只能随机选择其中一种进行复制。因此，会出现拷贝数偏差。两个不相容的质粒通常有不同的拷贝数，高拷贝数对复制抑制剂的敏感性低于低拷贝数。因此，当复制抑制剂(阻遏蛋白)的浓度较低时，高拷贝质粒仍然可以复制，从而可以消除(稀释)低拷贝质粒。3.质粒的分离和纯化1.氯化铯-EtBr密度梯度离心原理(1)宿主染色体DNA和质粒DNA的高级结构差异*质粒DNA分离纯化的分子本质是如何区分细胞破裂后释放的染色体DNA和质粒DNA混合物中的质粒DNA和染色体DNA，从而只获得质粒DNA。*然而，质粒D

15、NA和染色体DNA在化学结构上没有区别。因此，为了将质粒DNA与其宿主染色体DNA区分开来，达到分离纯化的目的，必须从其DNA的高级结构中寻找突破口。实验表明，在细胞裂解和DNA分离过程中，高分子量的细胞染色体DNA容易断裂成相应的线性片段，而质粒DNA由于其分子量小、结构紧凑而保持完整。氯化铯-EtBr密度梯度离心是一种经典的分离和纯化质粒DNA的技术，它是基于宿主染色体DNA和质粒DNA在高级结构上的差异(或异质性)。(2)CsCl的作用在氯化铯密度梯度离心中，氯化铯用作介质，其密度为1.7g/cm3。超速离心平衡一段时间后，形成1-1.9052克/立方厘米的连续浮力密度梯度。众所周知，大肠杆菌宿主染色体DNA、质粒DNA、大肠杆菌宿主染色体DNA和核糖核酸四种大分子物质具有不同的浮力密度，因此它们在超速离心平衡后会以等密度位置分布在CsCl连续密度梯度介质中，从而达到相互分离的目的：A.浮力密度=2.0g/cm3的核糖核酸大分子沉入离心管