福建农林大学分子生物学课件2.ppt

1、Enzymes for Molecular Cloning，酶，几乎所有生物都可以合成自己需要的酶，包括很多病毒。酶参与所有生命活动过程，细胞内分布、含量、活性等随着生物的生长、发育及外部条件的变化而变化。Ribozyme:具有催化能力的RNA。酶不都是蛋白质。定义：由活细胞生产，具有特殊空间结构的生物大分子(蛋白质、核酸等)，能在体外和体内产生相同的催化剂。如果在基因克隆中使用的酶、ER连接酶DNA聚合酶：Klenow酶、Taq酶、逆转录酶、末端转移酶碱性磷酸酶聚核苷酸激酶、RE、细菌中没有发现ER牙齿，现代生物学和重组DNA就无法发展。restriction endo nuclease d

2、efinition : molecular knives hundreds known，Commercially available . function : r-m defense mecesBiochemistry: need ATP，mg，Sam cutting:long sequences(1000-5000 nt)，at random un special，cant be used in和I应用程序一样，受到限制。II:应用最宽的酶是最简单的(Mg2)。不需要HsdM和HsdR子单位截断特异性。Derivation:第一条three names from the Latin name

3、s of the microorganism that produces them . first letter(genus)，next two letter酶，Recognition sequence : cleave DNA symmetrically in both strands at short palindromic(symmetrical)Recognition sequences to lealeas recognition sequence enzymes 5 gtt AAC 3 HPA blunt end 3 CAA TTG 5 gaat tc3 ecor 5 protru

4、ding end 3 CTT AAG 5 ag CTT 3 hind 5 protruding end 3 TTC GAA 5 gg atch PSTI(6bp)=1/46 4096 Noti(8bp)Restriction digests digestion of plasmid or genomic DNA，for analytical or preparative 也就是说，来源不同，识别序列不同，但产生相同粘性末端的酶。远距离裂解酶：识别部位与切割位置不匹配的可变酶：识别序列中一个或多个核苷酸可变的亚集酶：一个酶的识别序列是另一个酶的识别序列，enzymes activity，一个活性

5、单位：在适当的反应条件下，星号活力在酶名称的右上角加星号(*)表示，例如EcoR*。因此，酶只与在相当特殊的条件下发表的结果一致。必须采用规范的实验程序，应用推荐的反应条件。基质部位的优势效果，酶对同一DNA基质中不同酶的切割速度不同，应用含有50甘油的储存缓冲液透析，保存在-20。消化DNA时，用1-3个单位/l稀释。反应缓冲液可以在相关书上找到。酶促反应注意事项价格昂贵，为了防止变性人失活，用水稀释渡边杏。事先放入除酶以外的所有试剂。取酶，立刻放在冰上。分成小部分，避免重复董洁融化。使用无菌的新吸头。加水少，体积最小，但保证酶液的体积不超过总体积的10。否则，酶液的甘油会抑制酶活性。res

6、triction map DNA physical map:a series of er demonstration : linear or circle application:DNA sequencing，genome function提取：很多原核和真核生物及病毒。T4 DNA ligase多肽链(Mr=68000)也可用于RNA，但效率更低，需要ATP作为辅助元素。E.coli DNA ligase Mr=74000，具有5段磷酸基团的DNA基质NAD不能促进牙齿催化反应分子克隆的使用或连接RNA。用途： cDNA第二链合成。T4 RNA ligase通过噬菌体编码催化单链DNA或RN

7、A连接。主要用途是在RNA上做3个末端标记。ligation of DNA fragments in vivo and in vitro in vivo:不仅在形成重组分子方面效率低下，还可能伴随着端核苷酸的缺乏。In vitro:减少了DNA进入细胞后分解的风险。粘性末端外部连接保护了原始识别序列的完整性，并控制了连接时的反应条件。affecting factors T:大多数内切酶产生的粘性末端的Tm值小于15，但保持连接酶活性的最佳温度为37，因此最佳温度是粘性末端的Tm值和连接酶的最佳温度之间的折衷。经常使用12.5(4-15)。DNA concentrations:外源片段浓度比载体

8、DNA浓度高10-20倍，防止兑换。碱性磷酸酶字典处理质粒载体Time: O/N Better，聚合酶催化核酸体外合成反应，DNA聚合酶依赖DNA的DNA聚合，DNA聚合酶大片段(klenow片段)；耐热DNA聚合酶(Taq酶)依赖RNA的DNA聚合酶：逆转录酶。不依赖DNA的DNA聚合酶3360末端转移酶。依赖RNA聚合酶催化RNA体外合成反应DNA的RNA聚合酶不依赖DNA的RNA聚合酶，nuclease以核酸为基质的水解酶将RNase、DNase、非特异性核酸酶作用越来越分类为(内切或外切酶5-核酸)许多核酸酶是内切和外切活性，核酸酶的分类内切酶非特异性外切酶3-核酸酶RNA外切酶特异性非限制性内切酶限制DNA外切酶，牙齿酶很难纯化，酶产品总是不纯。锰离子是牙齿酶的强力抑制剂，在处理前，DNA不能溶解在含有铵盐的缓冲液中。低浓度磷酸也能抑制酶活性。磷酸酶：消除核