实验：细胞化学染色POX.ppt

1、细胞化学染色、昌注学专业学期技术学科后进纲、细胞化学染色是以形态为基础，结合化学或生物化学技术，对血细胞内的各种化学成分进行定位、定性和半定量分析的方法。用于研究血细胞的生理、病理和化学结构。临床上为特定血液病的诊断、鉴别诊断、疗效观察、预后监测及发病机制提供了重要依据。血细胞化学染色的基本要求是原地显示细胞成分和结构，反应产物作为有色沉淀物必须具有一定的稳定性。血细胞化学染色可以表示糖原，脂质，酶，蛋白质等。(a)固定有物理方法和化学方法，物理方法是干燥和火焰固定，化学方法最常用甲醛、乙醇、丙酮、乙酸等。血细胞化学染色过程，(2) 1，偶氮结合法：利用合成的酶基质在酶的作用下生产降解产物，然

2、后与中氮盐相结合，产生偶氮结合，形成不溶性偶氮色素，证明酶的存在。2.本齐民法：粒细胞和单核细胞的过氧化物酶作用于过氧化氢，释放新的生态氧，使无色的本齐胺形成蓝色沉淀。3，普鲁士蓝法：细胞内，外铁，酸性亚铁氟化钾作用，形成蓝色亚铁氟化铁沉淀。4.主厨反应：在高碘酸氧化细胞内的糖类中，乙醇基形成乙醛，醛和主厨的试剂使无色紫红色沉淀。5.金属沉积法其他有脂溶性染料染色(地质标记)、荧光标记、放射子现象、体外生物染色等物理方法。也经常用于临床血液细胞学诊断。(c)细胞化学定量粗略测定，染色反应的强弱，颜色的明暗，人为区分为声音和不同程度的阳性。百分法只能反映细胞阳性率，不能反映颜色强弱。积分法是常用

3、的半定量法，结合等级测量和百分比，反映细胞阳性率的高低，也反映细胞颜色的强弱。下面介绍对白血病鉴别诊断很重要的几种茄子常见细胞化学染色方法。1，过氧化物酶染色(POX)，(1)四甲苯胺(TMB) 原理粒细胞和单核细胞的细胞内浆内的骨髓过氧化物酶(POX orMPO)分解过氧化氢，释放新的生态氧，将无色苯乙胺氧化为蓝色联苯胺，0.1%TMB乙醇溶液lml，硫化铁氟化钠饱和溶液10l，混合溶液为浅棕色。2.在新鲜干燥的血小板中加入0.5毫升混合溶液，放置lmin后加入0.7毫升稀有过氧化氢溶液，染色6min。3.瑞士染液再染色1520分钟。4.检查油镜。结果细胞质中有蓝色黑粒的人是阳性的。()没有

4、粒子平静；()粒子小，分布稀疏。()颗粒较厚，有局部分布。()颗粒粗，分布紧密，占细胞质的1/22/3。()粗糙的粒子，块状分布；()所有细胞质都充满颗粒，能覆盖细胞核。，临床意义 (1)粒系：POX主要分布在粒球和单核细胞上，随着粒细胞成熟逐渐增强，中性叶核细胞呈强阳性。嗜酸细胞阳性率最强，其阳性粒子比中性细胞粗，折射光。碱性粒细胞是阴性。(2)单核细胞：原始单核细胞为阴性反应，幼稚单核细胞和成熟单核细胞呈弱阳性反应，颗粒较小，分散分布。(3)其他细胞淋巴细胞、肠细胞、遗迹血细胞、组织细胞、巨核细胞均呈阴性反应。(4)血小板过氧化物酶主要位于幼稚巨核细胞的核膜上，用作原核细胞的标记物，有助于

5、识别FAB M7。(5)过氧化物酶染色主要用于识别急性白血病类型，急性骨髓细胞白血病的阳性反应多，M3和M2型反应最强，MI和M5型反应弱，有助于区分M3型和M5型。急性淋巴细胞白血病具有POX阴性反应，是急性骨髓细胞和淋巴细胞白血病鉴别的重要指标。注意事项，涂层要新鲜制作，厚度适当。TMB配方在8588的乙醇溶液中染色效果好。不要使用9095乙醇。否则，细胞表面蛋白质会迅速凝固，妨碍试剂渗入细胞内，削弱或消失显色反应。过氧化氢溶液需要新鲜配方，其浓度和添加量不能随意更改。涂层颗粒细胞看不到良性颗粒，红细胞呈褐色或绿色，意味着过氧化氢太浓。过氧化氢添加到血小板中，如果不产生泡沫，就无效。染色值

6、必须为5.5。如果pH值为5.0，则结果为假阳性。试剂要放在低温的暗处，以防止光照射。染色时加入稀过氧化氢溶液后，应与染液充分混合。否则，同一部电影中细胞染色不一致。AML-M1，M1-POX()，第二，苏丹黑B染色，原理苏丹黑B (sudan black B，SB)是可溶于脂肪的色素染料。试剂甲醛溶液1。10%。2.苏丹黑B乙醇溶液，操作 1干燥血浆或骨髓板固定在甲醛蒸汽中。2冲洗自来水。3方磷染色液中37染色3060分钟。4 70%乙醇，12分钟脱色，水洗12min。5瑞士染液再染色2030分钟。结果脂质为黑色或棕色颗粒，在细胞膜上有小颗粒、小颗粒、稀薄颗粒、胞质局部面积的四分之一处有细密

7、颗粒。()黑色粒子出现在较小的粒子或复盖区域的二分之一处。()粒子密集，或在复盖区域的四分之三处出现黑色粒子。()粒子很密，粒子之间没有间隔。临床意义 1。粒细胞界早乳蛋及下一阶段随着细胞成熟，阳性颗粒逐渐增加。早期的原颗粒细胞一般是阴性，少数小的点状颗粒可以在线粒体染色的晚期原颗粒细胞中表示阳性颗粒，其颗粒仅限于细胞质的一个区域。(威廉莎士比亚，线粒体，线粒体，线粒体，线粒体，线粒体)，2。单核细胞系阳性，颗粒小，分布分散，形状不规则。原核细胞是阴性。3红细胞系、淋巴细胞系均为阴性反应4尼万1峰细胞和高舍细胞均为阳性反应。5苏丹黑B和过氧化物酶染色的临床意义相似，主要用于急性白血病类型的鉴别

8、。苏丹黑B染色比过氧化物酶染色更敏感，但特异性不如过氧化物酶染色(极少数急性淋巴细胞白血病可能是良性的)。M1-SBB()，M2-SBB()，3，和碘酸单萜(PAS)染色，原理细胞质是糖原或多党制，如点多糖、粘液、结果 (1)粒球系统：原征税炮大部分是阴性反应，也可能是弱阳性。早期婴儿细胞后，随着细胞的成熟度，阳性反应逐渐增强。嗜酸细胞颗粒本身不上色，但颗粒之间的细胞质呈现扩散性阳性反应。嗜碱细胞呈阳性反应，颗粒紫红色，大小不同。中性粒细胞糖原含量标准(-)细胞质无颗粒细胞质为淡红色，无颗粒(-)细胞质为红色，少量颗粒(-)细胞质为暗红色，颗粒较密(-)细胞质为洋红色，颗粒较密(-)细胞质为高

9、密度，高碘酸-淋巴细胞糖原含量标准标准(-)细胞质内没有颗粒。()细胞质内有颗粒。()有比较粗的红色颗粒。粗红色颗粒，粗红色颗粒。(3)红细胞系统：遗迹血细胞和红细胞有语音反应的红细胞系列糖原含量标准标准(-)细胞质无颗粒(-)几个红颗粒(-)。()有比较粗的红色颗粒或深红色牙齿。有粗红色颗粒或深红色牙齿。(4)巨核细胞：巨核细胞和血小板染色反应均位于阳性巨核细胞糖原含量标准标准标准标准标准标准(-)少量糖原包涵体中，等量糖原包涵体位于核膜排出或散布胞质1/3()大量糖原包涵体，血浆细胞大部分为阴性。组织细胞是语音反应。巨噬细胞呈阳性，能呈现红色颗粒反应。临床意义 (1)M6与巨大尤文的鉴别M

10、6的遗迹血细胞PAS呈强阳性，积分显着提高，对贫富，再生障碍，龙斌市PAS反应呈阴性。(2)急性白血病的类型鉴别ALL，PAS为大块阳性，但阴性。AML是语音。急性单核细胞白血病时，面料核细胞和有糖核细胞PAS阳性，点增加，阳性颗粒小，多，出现分散分布。all-L1，l1pas()，AML-M5，m5pas()，AML-M6，AML-M5(5)淋巴肉瘤、霍奇金病等淋巴细胞的糖原点升高。一般病毒感染，糖原点在正常范围内。4，中性细胞碱性磷酸酶染色，偶氮结合法原理中性细胞浆的碱性磷酸酶在pH 9.29.8缓冲液中水解磷酸酚钠，释放磷酸和萘酚。然后将重氮盐和萘酚结合，用不溶性有色偶氮染料沉淀到细胞质

11、中。结果犬江蓝RR阳性为紫色颗粒，犬江紫酱GBC阳性为褐色沉淀。“a”阴性反应，细胞质中没有阳性染色颗粒。“”细胞质中含有少量颗粒，或淡红色(或紫紫色)牙齿分散。“2”细胞质中含有等量的颗粒或分散颜色。“3”细胞质中散布着丰富的颗粒或深色，细胞核清晰。“4”具有很丰富的粗颗粒，胞质饱满，深色散开，胞核不清晰。中性细胞碱性磷酸酶(NAP)、偶氮结合法、NAP积分法计算100个成熟中性细胞，根据其反应强度分级，将各等级的百分比和其系列的乘积相加，就是积分。例如：NAP反应结果(%) (-) () () () () () 20 40 20 15积分=(020) (220) (315) (45)=14

12、5参考值中性细胞NAP活性积分值通常为1050分，但有时可达到162分。临床意义 (1)生理变化：新生儿NAP增加，成人比儿童减少，老人更低。激烈的运动增加。月经前增加，月经后减少，经过后期恢复正常。孕期2 三月轻量增加，以后逐渐升高，分娩时达到高峰，产后恢复正常。(2)，病理变化增加：严重化脓性感染，白血病反应，AA，CML加速器，ALL，CLL，恶性淋巴瘤，癌症转移，MM，真红，骨髓纤维化等。减少：PNH，CML，恶性组织细胞病，MDS。(3)疾病鉴别诊断慢粒子和类白色的鉴别：CML减少，类白色增加。急性白血病的鉴别：AML减少，ALL增加。PNH和AA识别：PNH减少，AA增加。医院微生

13、物的鉴别：病毒感染减少，细菌感染增加。NAP()，CML-NAP(-)，5，骨髓铁染色，原理正常骨髓的储藏铁主要存在于骨髓的小颗粒和红细胞中，骨髓中的铁在酸性环境中与亚铁氰化钾作用，形成普鲁士蓝反应，形成蓝色，化学反应过程为4 Fe3 K4Fe()少数铁球或铁球。()更多的铁球和铁球。()很多铁粒子、铁珠子和小块。()很多铁球、铁球和很多小块挤在一起。正常范围：“”占三分之二，“”占三分之一。细胞外铁，(2)细胞内铁观察：细胞内铁在核红细胞细胞质中出现蓝色颗粒。以类比法测定100个中，万无一失血细胞，记录细胞质量中含有蓝色颗粒(即铁粒红细胞)的比例。此外，根据细胞铁粒子的数量、大小、染色深度和颗粒分布，将铁红细胞分为4茄子类型。类型：仅含一到两个铁质粒子。类型：包含3-4个铁粒子。类型：包含6-9个以上的铁粒子。类型：10铁粒子。正常范围：30% 90%，平均60%，多见，稀有，无，类型。细胞内的铁，(3)环状铁粒红细胞：6个铁粒，其中2/3以上的铁粒在原子核周围排列成完整的环或不完整的环。正常或非铁粒、微贫血、无环铁粒、有细胞、铁粒、微贫血、中环形铁粒、有细胞6%。环铁颗粒幼细胞，临床意义 1缺铁性贫血，骨髓细胞外铁明显减少，只有“1”，“4”，细胞内铁的平均5.9%，I型。有效铁治疗后，外铁增多了。因此骨髓铁染色是诊断缺铁性贫血和