SILAC定量蛋白质组学技术简介.ppt

1、SILAC定量蛋白质组学,辉骏生物： 免费服务热线：400-699-1663,SILAC定量蛋白质组学,1：SILAC定量蛋白质组学原理 2: 应用 2.1：SILAC定量蛋白质组学 2.2: SILAC研究蛋白质相互作用 2.3：SILAC研究蛋白质与DNA相互作用 2.4：SILAC研究蛋白质与RNA相互作用,辉骏生物： 免费服务热线：400-699-1663,1：SILAC定量蛋白质组学原理,1.1：SILAC定量蛋白质组学的原理 1.2：SILAC技术流程 1.2.1：培养基准备 1.2.2：细胞标记与测试 1.2.3: 实验处理 1.2.3：蛋白质分离与质谱分析 1.2.4：结果形式

2、,辉骏生物： 免费服务热线：400-699-1663,SILAC法。 1、标记：在缺乏Lys和Arg的培养基中添加Lys和Arg的同位素Lys(D4或13C6 15N4)、Arg(13C6,或13C6 15N4)等培养细胞，使蛋白质被标记成“中型”或“重型”； 2、细胞处理，如药物处理； 3、细胞裂解、提取蛋白质； 4、等量混合对照与处理组蛋白质、SDS-PAGE电泳、染色； 5、割取蛋白质条带，胰蛋白酶消化，质谱分析。,1.1：SILAC定量蛋白质组学原理,1.1：SILAC定量蛋白质组学原理,技术优势目前比较蛋白质组学最先进方法 （1）高效性：SILAC是体内标记技术，标记效率可高达100

3、%； （2）定量精确：线性范围广，降低由于样品制备不同而造成的实验内差异； （3）高通量、灵敏度高：可同时鉴定并定量数百至数千种蛋白质，且检可测测到纳克级水平； （4）相容性：可以对多种在DMEM或RPMI 1640培养基中能够培养的细胞或细菌中表达的蛋白进行标记； （5）灵活性：在缺乏L-赖氨酸和L-精氨酸的培养基中添加同位素标记的这两种氨基酸，操作方便。,辉骏生物： 免费服务热线：400-699-1663,1.2.1：培养基准备,材料： （1）：Lys或（和）Arg缺陷型1640培养基， Lys或（和）Arg缺陷型DMEM培养基。 （2）：透析FBS。 （3）：稳定同位素标记的Lys和Ar

4、g。L-Lysine(13C6), L-Lysine (13C6,15N2), L-Lysine(13C6,15N2), L-Lysine(15N2,D9), L-Lysine(4,4,5,5-D4) ,L-Arginine(13C6), L-Arginine (13C6, 15N4), L-Arginine(13C6,15N4)。 培养基制备： 取相应量的稳定同位素氨基酸Lys和Arg各50mg,添加到500ml培养基中，同时添加血清（一般是10%）和抗生素后，0.22um滤膜过滤，4度保存备用。根据实验的需要，可以配制“中”型和“重”型培养基。,辉骏生物： 免费服务热线：400-699-1

5、663,1.2.2：细胞标记与测试,标记： 一般细胞经过添加同位素的培养基传代培养5-6代后，一天或2天传代一次，细胞中蛋白质的Lys和Arg将被同位素氨基酸取代。添加了稳定同位素（“中”或“重”型）的细胞与“轻”型细胞相比细胞生长速度可能偏慢，这是由于透析血清与中缺乏一些盐成分，可以让透析血清在PBS里面透析，透析膜的孔径一般为10KDa. 标记测试： 在进行正式实验之前，需要对细胞进行标记测试，测试细胞中蛋白质的Lys和（或）Arg是否被相应的同位素氨基酸取代。收取 蛋白质后，等量混合，SDS-PAGE分离，LC-MS/MS检测。,辉骏生物： 免费服务热线：400-699-1663,1.2

6、.2：细胞标记与测试,细胞经过传代培养7天后，同一肽段被“重”型肽段取代,辉骏生物： 免费服务热线：400-699-1663,1.2.3: 实验处理,当标记测试检测到蛋白质已被同位素氨基酸标记后，可以进行细胞处理，如药物处理，病毒处理等。,辉骏生物： 免费服务热线：400-699-1663,1.2.3：蛋白质分离与质谱分析,（1）：提取“轻”型”，“中”型，“重”型细胞蛋白质，等量混合，SDS-PAGE分离，染色。 （2）：割取蛋白质条带，胰蛋白酶酶切。 （3）：LC-MS/MS（仪器：LTQ Orbitrap XL)分析，数据检索。,辉骏生物： 免费服务热线：400-699-1663,1.2

7、.4：结果形式,LC-MS/MS分析结果，将会给出每个肽段的质谱峰图及定量信息。结果 将会已EXCEL表格呈现。 肽段质谱峰图及表达量：,2: SILAC应用,2.1：SILAC定量蛋白质组学实例 2.2: SILAC研究蛋白质相互作用 2.3：SILAC研究蛋白质与DNA相互作用 2.4：SILAC研究蛋白质与RNA相互作用,辉骏生物： 免费服务热线：400-699-1663,2.1：SILAC定量蛋白质组学实例,辉骏生物： 免费服务热线：400-699-1663,2.1 Schematic for SILAC,SILAC实验流程图,2.1 MS spectra showing the fo

8、ur major patterns of phosphorylation observed,辉骏生物： 免费服务热线：400-699-1663,SILAC定量结果图例，质谱峰的高度表示蛋白表达的相对强度,. Summary of fold change with Her2 for all 462 proteins, with several individual proteins high-lighted. Proteins with a ratio1.5(upperred line) are consideredas increased in their tyrosine phosphory

9、lation level,and those with ratios0.66 (lowerred line) are considered as decreased in their tyrosine phosphorylation level. In3T3-Her2cells,198 proteins showed significant increases in phosphorylation,and 81 proteins showed a significant decrease,2.1 Quantication of phosphorylation by SILAC,辉骏生物： 免费服务热线：400-699-1663,2.1 Conclusion,辉骏生物： 免费服务热线：400-699-1663,2.2 SILAC研究蛋白质与蛋白质相互作用,J. C