第十三章甾体激素类药物分析

1、第十章 甾体激素类药物 的分析,基本要求,一、掌握本类药物的化学结构差异与分析方法的关系 掌握“其它甾体”、特殊杂质检查方法的基本原理 二、熟悉四氮唑比色法、异烟肼法、Kober反应比色 法 熟悉紫外分光光度法含量测的基本方法和原理 三、了解HPLC法，本类药物的分类,基本结构：环戊烷骈多氢菲,A,B,C,D,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,分类：,甾体激素,肾上腺皮质激素,性激素,雄性激素及蛋白同化激素,孕激素,雌激素,肾上腺皮质激素,氢化可的松,肾上腺皮质激素,醋酸地塞米松,雄性激素,丙酸睾酮,蛋白同化激素,苯丙酸诺龙,孕激素

2、,黄体酮,雌激素,炔雌醇,一、结构与性质,1. 肾上腺皮质激素,2. 雄性激素及蛋白同化激素,3. 孕激素,4. 雌激素,二、鉴别试验,（一）与强酸的呈色反应,甾体激素类药物,呈色,H2SO4 H3PO4 HClO4 HCl,（母核）,(二) 官能团的反应,肾上腺皮质激素药物,呈色,四氮唑盐 OH,1 C17 醇酮基,还原性,A. 呈色反应,肾上腺皮质激素药物,Cu2O橙红色,碱性 酒石酸铜,B. 沉淀反应,Ag黑色,氨制硝酸银,甾酮类激素药物,呈色,羰基试剂,2. C3酮基和C20酮基,常用的羰基试剂： 2,4-二硝基苯肼、异烟肼、硫酸苯肼,异烟腙（黄色）,睾酮,黄体酮,异烟双腙（黄色）,具

3、有甲酮基或活泼亚甲基的甾体激素类药物,呈色,亚硝基铁氰化纳 间二硝基酚 芳香醛,3. 甲酮基,黄体酮,蓝紫色,亚硝基铁 氰化纳,其他甾体,淡橙色 不显色,黄体酮,蓝紫色,有机氟,F,有机破坏,有机氯,Cl,4. 有机卤素,茜素氟蓝 硝酸亚铈,硝酸硝酸银,AgCl,呈色,茜素氟蓝,蓝紫色,F-,雌激素类药物,红色偶 氮染料,重氮苯磺酸,5. 酚羟基,含炔基的甾体激素,银盐沉淀,硝酸银,6. 乙炔基,炔雌醇,白,KOH,(三) 制备衍生物测定m.p.,香,（四）水解产物的反应,特臭,特臭,-3-酮、苯环、其他共轭结构,1. 结构依据,240nm左右,280nm左右,（五） UV法,-3-酮 240

4、nm,苯环 280nm,2. 示例,曲安西龙,丙酸倍氯米松,溶剂,甲醇,乙醇,20g/ml,浓度,20g/ml,结果判断,在238nm处有最大吸收,在239nm处有最大吸收，A为 0.570.60，在239nm与263nm 处的吸收度比值为2.252.45,33003000cm-1,30002700cm-1,19001650cm-1,16501450cm-1,1000650cm-1,（六） IR法,37503300cm-1,醋酸可的松,结构特征：43酮、C17 OH C20 酮基、 C11 酮基、醋酸酯,1630cm-1,3420cm-,亚甲基、角甲基吸收带,1750cm-1,1232cm-1

5、,1052cm-1,结构特征：43酮、C17 OH C17乙炔基,炔诺酮,1650cm-1,3300cm-,3270cm-1,1615cm-1,结构特征：酚羟基、C17 OH C17 乙炔基,炔雌醇,1505cm-1,3505cm-,3300cm-1,1590cm-1,3610cm-,酚羟基,醇羟基,1615cm-1,苯环的骨架振动,（七） TLC法,主要用于甾体激素类药物制剂的鉴别,方法：对照品法 要求供试品溶液所显主斑点的颜色和位置与对照品溶液的主斑点相同。,炔诺酮 TLC图,（八） HPLC法,主要用于甾体激素类药物制剂的鉴别（如：醋酸曲安奈德软膏、醋酸氟轻松软膏）,方法：对照品法 要求

6、在含量测定项下记录的色谱图中，供试品峰的tR与对照品峰的tR一致。,三、 杂质检查,（一）其他甾体,定义 与标示药物结构不同的甾体化合物都称为“其他甾体”,Li/NH3 C2H5OH,弱酸,雌二醇3甲醚,苯丙酸诺龙的合成路线,I,II,强酸,苯丙酰氯,HCl,III,特点 （1）可能存在多个甾体杂质 （2）结构类似,2. 来源 原料、中间体、异构体、降解产物,4. 方法（具有一定分离能力） TLC法（高低浓度对比法） HPLC法（类似高低浓度对比法）,（1）TLC法（高低浓度对比法）,判定方法： 规定杂质斑点数目 规定杂质斑点颜色,醋酸氟轻松 检查 其他甾体,取本品加氯仿-甲醇（9 ：1）制成

7、3.0mg/ml作为供试液，精密量取适量，加氯仿-甲醇（9 ：1）稀释成0.06mg/ml作为对照液；照薄层色谱法，各取5l，分别点于同一硅胶G板上，以氯仿-甲醇（97 : 3）为展开剂，展开后晾干，在105干燥10分钟，放冷，喷以碱性四氮唑蓝试,液，立即检视，供试品溶液如显杂质斑点，不得多于2个，其颜色与对照液的主斑点比较，不得更深。,1,2,（2）HPLC法（高低浓度对比法）,判定方法： 规定杂质峰数目 规定杂质峰面积,取本品适量，精密称定，以无水乙醇为溶剂，配制成每1ml含2mg的溶液（1）与每1ml含0.04mg的溶液（2），用含量测定项下的方法和溶液(0.16mg/ml)，取10l注

8、入液相色谱仪，调整仪器灵敏度，使主成分峰高度达记录仪的满量程。再分别取溶液（1）,醋酸甲地孕酮 检查 其他甾体,和溶液（2）各10l，进样。记录至主成分峰保留时间的2倍。溶液（1）显示的杂质峰数不得超过4个，各杂质峰面积及其总和分别不得大于溶液（2）主峰面积的1/2和3/4。,供试溶液：溶液（1）2mg/ml,对照溶液：溶液（2）0.04mg/ml,特点： （1）需特殊的仪器； （2）不需对照品； （3）可以控制杂质的总量；,（二）游离磷酸,地塞米松磷酸钠 氢化可的松磷酸钠 倍他米松磷酸钠 氢化泼尼松磷酸钠,对照品法,原理：,方法：,检查 游离磷酸,地塞米松磷酸钠,精密称取本品20mg，置25

9、ml量瓶中，加水15ml溶解，精密加钼酸铵硫、酸试液2.5ml与1-氨基-2-萘酚-4-磺酸溶液1ml，加水至刻度，摇匀，在20放置3050分钟，照分光光度法，在740nm处测定吸收度，与对照液4.0ml同法处理的吸收度比较，不得更大。,（对照液 0.0035%KH2PO4）,（三）甲醇和丙酮,（灵敏度法）,甲醇 不得出峰 检测限= 3.1ng,丙酮 5.0% 内标法 + 校正因子,GC法,地塞米松磷酸钠,检查 甲醇和丙酮,精密称取本品0.16g，置10ml量瓶中，精密加内标溶液2ml，加水稀释至刻度，作为供试液；另精密量取甲醇10l(7.9mg)与丙酮100l(79mg)置100ml量瓶中，

10、精密加内标溶液20ml，加水至刻度，作为对照液。照气相色谱法测定，含丙酮不得过5.0%，并不得出现甲醇峰。,炔雌醇,（四）雌酮,原理 Zimmermann反应,碱性KOH乙醇,高纯度,来源 合成中用二氧化硒(SeO2)脱氢,剧毒,原理,方法,醋酸氟轻松 检查 硒 取本品50mg，照氧瓶燃烧法进行破坏后，将吸收液转移至100ml容量瓶中，用水15ml冲洗燃烧瓶及铂丝，并入吸收液中，用水加至刻度。取硒对照液（0.05ug/ml）和上述供试品溶液分别用氨试液调节pH值至2.0 0.2后，转移至分液漏斗中，用水,少量分次洗涤烧杯，洗液并入分液漏斗中，使成60ml，各加盐酸羟胺溶液（12）1ml，摇匀后

11、，立即精密加二氨基奈试液5ml，摇匀，在室温下放置100分钟，精密加环己烷5ml，强烈振摇2，静置分层，取环己烷脱水后，测A378nm。 规定 A供A对。,四、含量测定,（一）UV法,-3-酮 240nm（）,肾上腺皮质激素 雄性激素和蛋白同化激素 孕激素,苯环 280nm（）,雌激素,（二）反应分光光度法,1. 适用于非分光光度活性药物 2. 使待测组分光谱位移，避免干扰 3. 增加测定灵敏度 4. 增加选择性,弱、非分光光度活性药物,强分光光度活性药物,化学反应,肾上腺皮质激素类,C17 -醇酮基,强还原性,1. 原理,四氮唑比色法,O,OH-,分子重排,三苯甲瓒深红,蓝四氮唑（BT）,双

12、甲瓒（暗蓝）,2. 方法,ChP TTC（RT） BP TTC（RT） USP BT,对照品法,醋酸泼尼松龙软膏 含量测定 对照液：精密称取醋酸泼尼松龙对照品 20mg，置100ml量瓶中，加无水乙醇振摇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得。 供试液：精密称取本品4g（约相当于醋 酸泼尼松龙20mg），置烧杯中，加无水乙醇约30ml，置水浴上加热，充分搅拌，使醋酸泼尼松龙溶解，再置冰浴中冷却，滤过，滤液置100ml量瓶中，同法提取,三次，滤液并入量瓶中，加无水乙醇稀 释至刻度，摇匀，即得。 测定法：精密量取上述溶液各1ml，分 别置干燥具塞试管中，各精密加无水乙 醇9ml与氯化三苯四氮唑试液2ml

13、，摇匀，再各精密加氢氧化四甲基铵试液1ml，摇匀，在25暗处放置4050分钟，照分光光度法，在485nm的波长处分别测定吸收度，计算，即得。操作应避光。,3. 讨论,（1） 基团对反应速度的影响,C11= O C11OH,C21OH C21-酯,C16无论何种取代基,（2） 溶剂、水分的影响,含水量5%,含水10%A10% 含水30%几无反应, 无水乙醇,（3） O2与光线的影响,反应过程 反应产物,怕光,避光、快速,O2影响颜色强度和稳定性,隔绝空气、 快速、充N2,（4）碱的种类及加入顺序,反应应在强碱性（pH13.75） 条件下进行 以氢氧化四甲基铵的结果最佳,加入顺序：,（5） 温度与

14、时间,t甲瓒分解%,4. 特点： 缺点 影响因素太多 优点 测定结果能指示药品 的稳定性（氧化及降 解产物无此反应）,肾上腺皮质激素、 雄性激素和蛋白同 化激素、孕激素,C3酮基,1. 原理,异烟腙（黄色）,2. 方法,暗45,对照品法,3.讨论,反应速度,（1）,C3= O C17= O 、 C20= O C11= O 不反应,反应专属性 C3酮基,（2）溶剂的选择,异烟肼盐酸盐甲醇、乙醇,无水甲醇 无水乙醇,（3）水分、O2与光线的影响,含水量腙水解A%,不挥发溶剂、不吸收水分时 O2与光线无影响,酸、异烟肼的量,(3),盐酸 : 异烟肼 = 2 : 1,样品 : 异烟肼 = 1 : 8

15、,t ,1. 原理,雌激素,雌二醇-3-甲醚,max=465,max=515,(NH4)2Fe(SO4)2 + H2SO4 + H2O2 + 苯酚,Iron-phenol Reagent,2. 特点： 优点 较高的灵敏度 具有一定的选择性 缺点 非化学计量反应 反应应控制条件 注意平行原则,USP、BP、JP均采用,RPHPLC（大多内标法）,特点 用样量少，灵敏度高，分离效 果好，测定速度快,（甾体激素类药物常含有结构相似的其他甾体杂质，对利用结构特征设计的比色法有干扰）,方法 官能团 对象 紫外 4-3-酮，1，4-3-酮 肾上腺皮质激素 芳香A环，酚羟基 雌、雄激素，避孕药 四氮唑 17

16、位-醇酮基 肾上腺皮质激素 异烟肼 4-3-酮，1，4-3-酮 肾上腺皮质激素 雄激素，孕酮 铁-酚 酚羟基 雌激素 2，4-二 4-3-酮，1，4-3-酮 肾上腺皮质激素 硝基苯肼 C20酮基硝基苯肼 雄激素，孕酮 苯肼 17、21-二羟基-20酮基 肾上腺皮质激素 硝酸银- 乙炔基 含乙炔基 氢氧化钠,结构与含量测定总结,练 习 题 1.甾体激素类药物的结构中能和四氮唑盐发生显色反应的基团 A. 酚羟基 B. 活泼次甲基 C. 甲酮基 D. C17 -醇酮基 E. 酮基,2. 用异烟肼比色法测定甾体激素药物含量时，其溶液的环境是 A强酸性 B中性 C强碱性 D弱碱性 E以上都不对,问题37 A维生素B1 B醋酸地塞米松 C两者皆是 D两者皆不是 3. 异烟肼比色法 4. 硫色素反应 5. 紫外分光光度法 6. 羟肟酸铁反应 7. 绿奎宁（Thaciaquin）反应,B,A,C,D,D,8.可用于氢化可的松鉴别的试剂有 A氨制硝酸银 B异烟肼 C红四氮唑 D硫酸 E重氮苯磺酸,9.能与亚硝基铁氰化钠反应生成兰 紫色的药物是 A雌二醇 B黄体酮 C醋酸可的松 D苯丙酸诺龙 E以上都不对,10. 各国药典对甾