植物细胞大规模培养及有用物质生产(PPT 63页).ppt

1、植物细胞球的大规模培养和有用物质生产(1)，概括(2)，植物细胞球规模化培养系统的建构(3)，利用细胞球培养生产有用物质，植物次级代谢产物：植物中的一个不是植物生长发育所需的小分子有机化合物，其发生和分布通常为属，包括器官组织和生长发育期的专一性。 植物中二次产物的合成和分解过程称为次级代谢。 (1)、概要、植物产生代谢产物的类型大致可分为分子结构：酚类化合物：类黄酮类醌类(苯醌、萘醌、蒽醌)萜类化合物：三萜类化合物皂角苷； 甾类化合物皂角苷； 单萜烯、倍半萜、二萜类化合物含氮化合物：生物碱； 胺类(一级、二级、三级、四级胺)的非蛋白氨基酸能产生氰乙炔类、有机酸，植物次级代谢产物在压电石英药、

2、食品、轻化工业等领域具有重要意义。 李时珍列入本草纲目的1892种药物大部分是植物药物，现在约25种法定药物来源于植物。 其药物的有效成分均为副产物。 许多植物次级代谢产物是优良的食品添加剂和珍贵的化妆品原料。 部分是生物毒素的主要来源，可用于杀虫、杀菌，但对环境和人畜无害是理想的环保产品。自然植物和细胞球培养的紫草宁含量比较生产方式生产周期紫草宁含量(干重)完全植物23年12植物细胞培养3周14植物次级代谢产品的市场潜在能力产品成分用途年销售额(亿美元)长春花碱治疗白血病1820 (美国)奎宁治疗疟疾510 (美国) 热致杀虫剂20 (全球)地黄心脏病药2055 (美国)、植物细胞球大规模培

3、养的技术要求：从工程细胞球的生长和培养技术方面来看，为了得到产量一定的产物，1、培养的细胞球必须满足3个条件：遗传稳定。 2、细胞球生长和生物合成速度快，可在短时间内得到高产的最终产物。 3 .代谢产物最好能储存在细胞球中，释放到培养基中，以免迅速分解。 (二)、植物细胞球规模化培养系统的建构1、种子细胞球的选择(1)正确选择可产生目的化合物的植物种类(2)尽可能选择自然状态下可产生天然产物的组织器官作为外植体(3)高产种子细胞克隆的方法：单细胞球培养后，对单细胞扩增产生的愈伤组织进行2份、一份成分含量分析，另一份保留培养。 2、种子细胞系增殖和扩大培养种子细胞球增殖初期一般采用摇瓶培养，摇瓶

4、体积从数百毫升逐渐扩大到数公升。 如果细胞球数增加到一定值，则转移到体积小的生物反应器中进行培养。 3、大规模培养系统的建构(1)统一培养：在一个培养体积中接种细胞球或添加培养基后，中途不更换培养基的方式。 (2)连续培养：在培养过程中，不断在反应器中以一定产水量添加新培养基，并以一定产水量从系统中提取培养基的方式。 (3)半连续培养：批量培养一个周期结束后，从反应器中取出大部分细胞球混悬剂，仅保留小部分细胞球混悬剂作为下一个培养周期的种子细胞球，然后加入新鲜培养基进行培养的方式。 (3)生物反应器的类型和特征大规模培养系统的基本原理方法与上述实验室悬浮培养相一致，但大规模培养采用的设备和控制

5、技术比实验室小规模培养复杂得多。 植物细胞培养具有周期长、细胞球抗剪能力弱、易凝聚等特点。 在云同步，植物细胞球规模培养的目的是生产天然产物，因此必须考虑修订植物细胞培养反应器不仅有利于细胞球的生长，也有利于产物的积累和分离。总体而言，适于植物细胞培养的反应器应具有适宜的氧传递、良好的流变性和低剪切力。 机械搅拌式培养系统机械搅拌式生物反应器通常根据微生物发酵槽改良设定，根据植物细胞球的特性，根据微生物发酵槽化学基，搅拌装置减少剪切，一般将叶轮式变更为螺旋式，植物细胞的生长周期长，需要随时补充水分和营养， 由于需要安装修订加液装置的植物细胞球的大姨妈活动需要新鲜空气，细胞球代谢也可能产生有害瓦

6、斯气体，因此为了便于安装修订通气装置的采样观察，还设置了采样通讯端口。 生物反应器、Stirred Tank Bioreactors、 anexternalmotorisusedtoagitatethegrowthmediumwithimpellers.sterileairorcombinationsofgasescanbeintroduced (sparkling )气压搅拌式培养系统考虑到免不得机械搅拌式反应器的剪切作用，搅拌机旋转的中轴大多是容易污染培养物的部位，所以开发了空气提升式生物反应器，但存在搅拌不均匀的缺点。bubblecolumnbioreactor (airlift rea

7、ctor )、introductionofsterileairorpuregasesisusedbothforagitationandoxygenation、internal loop tubeplacedinsidethereactorcreatesinternalcirculationloop，外部环形airlift生物反应器。 circulationthroughanexternalloop，旋转式培养系统一般用于产品中试验、不分解细胞球才能得到目标物的培养，其优点是控制精确、处理灵活、缺点是培养体积小。 固定化培养系统这一技术的优点是，培养系统的理化化学环境可比较容易控制、研究特定代谢

8、途径、调节简单的细胞球定位于植株中间的状态，可相互紧密接触形成一定的理化梯度， 有利于二次产物合成的细胞球由于固定在载体上，培养基可不断交换，从培养基中提取产物，由于培养基中含有许多初生产物而免除了细胞球代谢的种子文件回归抑制，由于细胞球残留在反应器中，新的培养基就可以再利用这些个的细胞球来生产初生产物， 因为节省了生产细胞球的时间和费用的细胞球固定在一定的介质上，可以从培养基中持续提取生成物，从而可以进行连续生产。 细胞球固定化培养技术，根据其载体可分为两类：包埋式固定化培养系统：载体多采用琼脂、琼脂、藻朊酸盐、聚酰胺等吸附式固定化培养系统：载体采用尼龙网、乌拉坦泡沫、中空纤维等材料。 (1

9、)利用细胞球培养生产有用物质的一般普洱茶(1)选项必须注意以下条件：药效是肯定的，对其有效成分一盏茶了解的有效成分和药理有测定可靠方法市场不足，或取价格高的有药效成分的部位，该部位是卡尔(四)细胞球培养生产有用物质；(二)细胞球株系通过诱导分离愈伤组织，建构悬浮细胞球繁殖系统(液体培养)。 在工厂化生产中，为了提高有用物质产品的产量和质量，对细胞球培养的选择有两个基本要求：有用物质的合成积累能力强，生长速度快；(3)大量培养是将选择的优良细胞球株扩大繁殖后，作为细胞球工厂化培养的生产“种子”进行大量培养。 (4)从产品的提取和精制植物细胞培养物中提取和精制的产品。 2、提高有用物质生产效率的技

10、术因素筛选高产细胞系从实验材料中筛选高产细胞球株系是提高生产率、降低生产成本的重要因素。 特异的次级代谢产物往往形成于特异的器官之中。 因此，以特异器官为材料，建构特异功能的细胞系，从中筛选出反复多代培养的有效高产的细胞球株。筛选的高效、高产细胞球株系、某些植物细胞系高效、高产性能多年稳定，而某些植物细胞系不稳定，需要定期检测更新细胞球株系。 第一步：解决生质能源生产(促进细胞分裂)第二步：促进次级代谢物合成，即细胞球指数增长停搏前后更换培养基，有利于二次生质能源的积累。 二步培养法，培养基中添加的前驱物：有用的次级代谢物的前驱物。 在烟愈伤组织培养中，加入前体物质烟酸，烟碱的生成量就会增加。

11、 培养基中生长调节剂的作用植物生长调节剂不仅影响植物的脱分化和再分化，还影响次级代谢物质的产生。 在烟草愈伤组织培养中，可以在培养基中添加IAA来合成烟碱，但是在含有2，4-d的培养基中烟碱的合成受到阻碍。 培养条件的影响光、温度等影响次级代谢。 胡萝卜愈伤组织培养中，光照条件下紫红愈伤组织可生成大量花节氰苷类，且低温条件下生成量高。 采用固相细胞球培养系统细胞球生长分裂旺盛时，次级代谢物的产量较低。 采用固相培养，将细胞球培养为惰性基质，细胞球生长缓慢，可提高次级代谢物质的产量。思考题1好的悬浮细胞系有什么特点？对建构悬浮细胞系的愈伤组织有什么要求？ 2建构悬浮细胞系的关键技术是什么？ 3悬

12、浮细胞系在继代培养有集体成长规律吗？ 4细胞球大规模培养有哪些培养系统紫杉醇：二萜类化合物类化合物最早从太平洋红豆杉Taxus brevifolia的树皮中分离，广泛用于卵巢癌、乳腺癌、非小细胞球肺癌等十多种癌的治疗，目前主要来源于红豆杉属植物，紫杉醇简介、理化性质、 英文名： Paclitaxel，Taxol or TM分子式： c440 pH 8容易分解的紫杉醇可以在特定条件下氧化，但还原极为困难，紫杉醇的研究开发过程， NCI是过去15年研制的最优秀抗癌药物20世纪90年代抗肿瘤药的三大成果之一汤姆森科学技术桂冠奖，Ramesh Panchagnula，internationaljour

13、nalofpharmaceutics.1998 (172 ) 抗癌一线药的销售额，一年5亿美元的理论需求量为2g /人，500万人/年1000kg/年的实际销售量为350 kg/年，紫杉醇的供求有相当大的差别，图1 :国际紫杉醇原料药的需求动向图(单位： kg )，图2 :国际紫杉醇的销售上游产业药源问题下游制剂产业药效(活性、水溶性)安全性生物相容性、药源问题， 红豆杉主要原料植物国家一级保护野生植物世界10大濒危种之一是生长缓慢分布的有限Taxol含量低的树皮中的Taxol含量为：0.00001-0.069% 3000棵树=10吨树皮=1kg Taxol=500人的患者，人工栽培是种子繁殖

14、， 扦插等无性繁殖方法快，采用大面积人工繁殖红豆杉幼苗寻找红豆杉替代物，从红豆杉非树皮部位提取生产紫杉醇的非红豆杉植物，优点：生长周期缩短简便，直接，缺点： 1，紫杉醇含量低生长慢2，提取工艺复杂，药源问题解决方法(1)、 药源问题解决化学合成全合成1994年成功的目前6个途径半合成是以10-DAB和Baccatin为半合成原料得到紫杉醇的新方法采用10-DAT，缺点： 1，合成过程复杂，几十步2，费用高，化学制剂昂贵，总收率过低(2% )。 充分利用再生资源2，生产效率高，具有最实用的价值，可以进行工业生产，取得紫杉醇的结构效果关系信息，可以进行结构改造，缺点：合成过程相对复杂(11阶段化学

15、转化和7阶段分离)，药源问题解决方法(3)、 生物方法组织和细胞球培养微生物发酵生物合成研究阶段的红豆杉生物合成路线基本上有10种相关酶催化剂基因爱沙尼亚克朗表达，利用基因工程手段改造红豆杉，有利于提高紫杉醇产量的分离纯化4，低成本，生长周期短5，为半合成提供原料6，有望工业化生产，缺点： 1， 产量低，不稳定2，工业化扩大研究，水溶性紫杉醇使用0.77mM/L增加溶剂差：聚氧乙烯蓖麻籽油和乙醇问题稳定性和水溶性差(7mm )我国是中药饮片资源最丰富的国家，有详细记载的约5000种。 中药饮片治疗疾病的历史长达一千年，中药压电石英已形成完整的科学系统。 植物药效成分研究形成了“天然药物化学”研

16、究的新领域。 在药用植物中，具有药物功能的物质种类很多，结构复杂。 除了小分子的天然有机化合物以外，还有很多生物大分子活性物质。 不同组方的药用成分和功能研究是一项巨大的工程，相当于染色体组和蛋白质组研究。中药饮片复方复杂系统研究(北京牌高等院校汉启德院士)，二、植物来源药物种类1、天然有机化合物(1)糖和氰苷类类(2)苯丙类：苯丙酸、丙酸、库陆战队员等(3)醌类：补酶催化剂Q10、紫草素(。 (6)萜类：青蒿素、齐墩果酸(7)甾类化合物：牛葡萄糖苷、毛第黄毒葡萄糖苷(8)生物碱：咖啡因、喜树盐化学基、2、植物蛋白、多肽、酶催化剂类生理活性物质表2-16 3，植物糖类药物含单糖表2-17 4，植物脂质药物(1) 脂肪和脂肪酸类：亚油酸、亚麻油酸、花生四烯酸油脂(2)磷脂复合物类：大豆磷脂复合物(3)固醇类：豆固醇、-谷固醇。 三、植物来源药物的植被实例1、植物SOD 2、植酸钙元素镁和肌醇3、植物不饱和脂肪酸4、植物来源药物的研究前景1、植物细胞培养2、植物组织培养3、有效成分的分离、纯化、结构和功能测定。 3、生产一些有用物质，生物碱多数生物碱已经被用作医药。 吗啡等生物碱通常可从鸦片中提取，用作神经麻醉剂，利用罂粟种子愈伤组织培养可提取吗啡碱及其生物碱。 氰苷类物质利用胡箩卜愈伤组织培养生产皂角苷，进入工厂化生产。 醌系物质利用紫草